电泳分离法课件.pptxVIP

电化学分离方法; 概述 电化学分离法的定义： 基于原子或分子的电性质以及离子的带电性质和行为进行化学分离的方法。 电化学分离的特点： ??操作简单，往往可同时进行多种试样的分离； ??除消耗一定电能外，化学试剂消耗少，放射性污物少； ??分离速度比较快（除自发电沉积和电渗析），尤其高压电泳，即使复杂样品也能快速分离。 ;1 自发电沉积 2 电解分离法 3 电泳分离法 4 电渗析分离法 5 化学修饰电极分离富集法 6 溶出伏安法 ;电泳分离方法;一、电泳分离法的发展和特点;前 言;电泳;简单定义：电泳;Arne Wilhelm Kaurin Tiselius;电泳特点;电荷移动规律;应用领域;电泳种类I ：;电泳种类II ：;等电聚焦电泳 　　是将两性电解质加入盛有pH梯度缓冲液的电泳槽中，当其处在低于其本身等电点的环境中则带正电荷，向负极移动；若其处在高于其本身等电点的环境中，则带负电向正极移动。当泳动到其自身特有的等电点时，其净电荷为零，泳动速度下降到零，具有不同等电点的物质最后聚焦在各自等电点位置 ，形成一个个清晰的区带，分辨率极高。 ;区带电泳1;区带电泳2;区带电泳3;电泳分离原理; 在电场强度为E的电场作用下带电荷Q的粒子的迁移率μ表示为： ν为带电粒子的运动速度；η为介质的黏度；r为带电粒子的半径。因此一定实验条件下，各种带电粒子的μ值是一个定值。 根据离子迁移率的定义，还可以写成： ;影响电泳的因素;2 缓冲液的离子强度 低离子强度时,迁移率快,但离子强度过低,缓冲液的缓冲容量小,不易维持pH恒定. 高离子强度时,迁移率慢,但电泳谱带要比低离子强度时细窄.通常溶液的离子强度在0.01-0.1M之间. ;3. 电场强度 电场强度(电势梯度Electric field intensity)是指每厘米的电位降(电位差或电位梯度).电场强度对电泳速度起着正比作用,电场强度越高,带电颗粒移动速度越快. 　　 ;根据实验的需要,电泳可分为两种:一种是高压电泳,所用电压在500～1000V或更高.由于电压高,电泳时间短(有的样品需数分钟),适用于低分子化合物的分离,如氨基酸,无机离子等.因电压高,产热量大,必须装有冷却装置,否则热量可引起蛋白质等物质的变性而不能分离,还因发热引起缓冲液中水分蒸发过多,使支持物(滤纸,薄膜或凝胶等)上离子强度增加,以及引起虹吸现象(电泳槽内液被吸到支持物上)等,都会影响物质的分离.另一种为常压电泳,产热量小,室温在10～25℃分离蛋白质标本是不被破坏的,无需冷却装置,一般分离时间长. ;4. 电渗现象 在电场中液体对于一个固体的固定相相对移动称为电渗.在有载的 电泳中,影响电泳移动的一个重要因素是电渗. 产生电渗现象的因 是载体中常含有可电离的基团,如滤纸中含有羟基而带负电荷,与滤 纸相接触的水溶液带正电荷,液体便向负极移动.由于电渗现象往往 与电泳同时存在,所以带电粒子的移动距离也受电渗影响。;二、电泳分离法的类型和应用; 电泳分为前流型和区带型两种： ??前流型：无支持体的溶液自由进行的电泳； ??区带型：在支持体上进行的电泳，实际中应用更广。常用的支持体有纸、薄板、纤维素、毛细管等。;应用实例：纸上电泳分离金属 ?? 电泳纸处理:色谱纸切成46.2×2cm,浸入0.025mol/L五氯化锑的4M HCl溶液中,取出,室温干燥。后浸入25mM硫酸铈铵溶液,取出滤纸吸干,离子水洗涤,除去过量硫酸铈铵溶液,室温干燥。 ?? 分离测定：以0.1MHCl或0.1MHCl+0.1MNH4Cl(1+1)作背景电解质,滴入待分离试样溶液,在150V电压下，电泳4h，使Pd与Bi、Cu、Cd、Co、Ni、Au等分离，取出纸片，干燥，切出圆点面积，用10%HCl溶液（2×20mL）溶解，Pd被洗脱，用亚硝基二甲基苯胺作显色剂，分光光度法测定钯。;凝胶电泳分离DNA 凝胶电泳是一大类技术，被科学工作者用于分离不同物理性质（如大小、形状、等电点等）的分子。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10g的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。 此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆技术操作。;凝胶电泳 琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。 琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。 聚丙烯酰胺分离小片段