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Gateway载体构建系统 主要内容 什么是Gateway技术 Gateway克隆原理 Gateway技术的特点 Gateway技术的改进与发展 为什么要构建Gateway载体系统？ 传统的酶切连接方法的缺陷 1、需要繁琐的酶切连接，工作量大，难 以满足大规模克隆的需要。 2、往往难以找到合适的酶切位点而面临诸多的技术困难，影响实验的效率。 Gateway克隆（通路克隆） Gateway克隆技术是一个高效的大规模克隆系统，由Invitrogen公司开发。该技术利用λ噬菌体的位点特异性重组(λ噬菌体用此重组系统进行裂解途径和溶原途径之间的互相转换)，实现了不需要传统酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，同时还保持正确的ORF和插入方向。 基于λ噬菌体位点特异性的重组主要涉及两个成分： 1、DNA重组序列 即att位点（包括att B 、att P 、att L 、att R） λ重组反应就是发生在这些特异的att位点上，重组反应中交换位点实际上只是发生在两个位点核心的15bp同源区域，不过核心外围的序列也是不可或缺的，它们含有重组蛋白的结合位点。 2、介导重组反应的蛋白（克隆酶混合物） BP克隆酶混合物：λ噬菌体整合酶（Int）、大肠杆菌整合宿主因子（IHF） LR克隆酶混合物：λ噬菌体整合酶（Int）、切除酶（Xis）、大肠杆菌整合宿主因子（IHF） Gateway克隆原理 Gateway技术由两个基本反应组成： BP反应 LR反应 通过BP反应(attB×attP)得入门克隆(Entry clone)后，再通过LR反应(attL×attR)将目的DNA以正确的方向连接到各种目的载体上(Destination vector). 其基本过程可以表示为:attBXattP←→attLXattR BP反应 BP 反应是利用BP 克隆酶混和物催化一个带有 attB 位点的 DNA 片段或表达克隆和一个带有attP 位点的供载体 ( donor vector) 之间的重组反应，把目的片段及其两端部分位点转移至供载体中，创建一个入门克隆，其结构为 attL1-基因-attL2。同时，供载体中的 ccdB 细胞死亡控制基因及其两端部分位点被置换出来，单独或融合到表达载体中而形成副产物。 LR反应 LR 反应是利用 LR克隆酶混和物催化一个带有 attL 位点的入门克隆和一个带有 attR 位点的目的载体之间的重组反应，使目的片段及其两端部分位点取代目标载体( destination vector) 的 ccdB 基因及其两端部分位点而产生最终的表达克隆，其结构为 attB1-基因-attB2。副产物为带有 attP 位点的供载体。 首先LR克隆酶识别attL和attR位点，然后在载体的融合一分解、位点结构重新分配过程中，入口克隆(Entry clone)中的目的基因及其两头的黑色部分attL位点,取代目标载体(Destination vector)的ccdB基因及其两头的灰色部分attR位点，形成表达克隆(Expression clone)。此时，紧靠目的基因的黑色部分attL位点与远离ccdB基因的黑色部分attR位点重组，形成attB位点;余下的灰色部分重组形成attP位点。 BP反应与LR反应相反，重组蛋白组成的BP克隆酶混和物催化表达载体attB间的目的基因转到供载体中，形成新的人口克隆，此克隆又可与其它目标载体重组产生新的表达载体。 上下游引物中分别加入attB序列，产物与含有attP位点的载体重组，进行PCR产物的直接克隆 Gateway技术的特点 1、可以快速而高效的实现DNA序列在多种载体系统的转移，同时保证正确的方向和阅读框。 2、对载体和宿主没有依赖性。 3、可使用并表达来自多种类型的DNA序列，如PCR产物、cDNA克隆、酶切片段等。 4、适合于将大量的DNA序列转移到各种不同的表达载体上。 5、系统通用。可以通过添加Gateway盒轻易地将自己感兴趣的载体改造成Gateway目的载体。