荧光假单胞菌短链脱氢酶的克隆、表达和酶学性质分析.pdfVIP

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2011, September 25; 27(9): 1317−1325 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ ©2011 CJB, All rights reserved. 工业生物技术 荧光假单胞菌短链脱氢酶的克隆、表达及酶学性质分析 薛群，应向贤，杨池，汪钊 浙江工业大学生物与环境工程学院，杭州 310014 摘 要: 为了研究荧光假单胞菌中短链脱氢酶的生理角色和催化特性，从荧光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens GIM1.49 基因组 DNA 克隆表达了一个短链脱氢酶的编码基因pfd ，并分析了该基因产物的酶学性质。基因pfd 全长 684 bp ，编码 227 个氨基酸，推算分子量为 24.2 kDa 。将携带短链脱氢酶基因的重组质粒 pET28b-pfd 转入大肠杆菌 BL21(DE3) 进行表达，得到了28 kDa 的表达产物。重组荧光假单胞菌短链脱氢酶 (PFD) 能氧化4- 氯-3-羟基丁酸乙酯、 1-苯乙醇、苯甲醇、仲丁醇和还原 4- 氯- 乙酰乙酸乙酯、2- 溴-苯乙酮、4- 溴-苯乙酮等底物。以 4- 氯-3-羟基丁酸乙酯 为底物时活力最高，K 值为 186.90 mmol/L，V 为 89.56 U/mg。氧化4- 氯-3-羟基丁酸乙酯时，最适反应温度和 pH m max + 分别为 12 ℃和 10.5，倾向于利用NAD 作辅酶；而还原4- 氯- 乙酰乙酸乙酯时，最适温度和pH 为24 ℃和8.8 ，倾向于 利用NADPH 作辅酶。重组PFD 能耐受50 ％ ( V/ V) 的甲醇等有机助溶剂，Ca2+ (1 mmol/L) 和EDTA (5 mmol/L) 对其 酶活有一定的促进作用。上述结果表明，重组PFD 是一个新型的短链脱氢酶，其代谢角色推测与卤代次级醇的氧化降 解有关。 关键词: 短链脱氢酶，荧光假单胞菌，克隆与表达，酶学性质 Cloning, expression and characterization of a short-chain dehydrogenase from Pseudomonas fluorescens Qun Xue, Xiangxian Ying, Chi Yang, and Zhao Wang College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China Abstract: To explore the physiological role and biocatalytic properties of short-chain dehydrogenases from Pseudomonas fluorescens GIM1.49, we cloned the structural gene pfd and characterized its over-expressed product. The length of gene pfd was 684 bp encodi