PCR核酸扩增仪2.ppt

内容提要 1. PCR基因扩增仪的工作原理 PCR技术的原理及发展 PCR基因扩增仪的工作原理 2. PCR扩增仪的分类与结构 定性PCR扩增仪 实时荧光定量PCR扩增仪 3. PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除 PCR扩增仪的性能指标 PCR扩增仪的操作规程 PCR扩增仪常见故障的排除 4. PCR扩增仪的应用 第一节 PCR基因扩增仪工作原理 一、PCR技术的历史发展及原理 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种体外DNA扩增技术。在它发明以前，对于检测对象浓度非常低的标本，人们没有办法用常规方法测定。 1971年，Kleppe等人首次在文章中准确、客观地阐述了PCR方法。 1985年，美国PE-Cetus公司的Kary Mullis等人发明PCR技术。它推动了现代医学由细胞水平向分子水平、基因水平发展，是DNA测序的基础，它成为现代分子生物学发展过程中的一座里程碑。 PCR技术是在试管中（体外）给DNA的合成提供一种合适条件--模板DNA 、dNTP、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合适的缓冲体系，及让DNA变性、复性及延伸的温度和时间，使DNA能够体外复制。Mullis等因此项技术获得1993年诺贝尔奖。 PCR原理及其步骤：加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下加入的引物同模板DNA杂交，在Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复 “变性→退火→引物延伸”过程至25-40个循环，待测样本中的核酸拷贝数呈指数级扩大。 其过程1：加热变性 加热（通常93℃左右）可将双链DNA分为两条单链，称之为“变性”。　　因为连接碱基之间的氢键较弱，它们在高温下断裂，而脱氧核糖和磷酸之间的共价键结合力较强，在高温下保持不变。  过程2 退火，引物与靶序列结合 引物是短的、人工合成的单链DNA序列，有20-30个碱基，具有标记的5’端，便于下一步检测。它们对于待扩增的靶核酸是特异的。 PCR反应需有两条引物，每一条都与变性过程中产生的DNA单链互补。 退火温度：通常在40-65℃进行，视引物的长度和碱基序列而定。这样保证了引物与靶序列退火结合的高度特异性。注意：PCR反应并不是复制整个DNA链，而是复制某一段生物体特异的100-600个碱基对的靶序列。 过程3：延伸 一旦引物与互补DNA序列退火，温度即提高至近72℃，Taq DNA聚合酶被用于复制DNA链。 Taq DNA聚合酶是一种来源于嗜热水生菌（Thermus aquaticus）的重组的热稳定的DNA聚合酶，与一般聚合酶不同的是在高温状态仍具有活性。 Taq DNA聚合酶在引物标记的地方开始合成。它使溶液中自由的互补核苷酸（dNTPs）的掺入和结合，合成与目标DNA区域原始双链一样的新的双链DNA分子。 延伸通常起始于引物的3’端，从而使得单链变为双链。Taq DNA聚合酶特定地从5’端到3’端合成。因此，溶液中的自由的核苷酸仅加于引物的3’端，形成靶DNA序列的互补链。 30次循环后靶序列扩增的数量---（10亿） 二、PCR核酸扩增仪工作原理与控温方式 在PCR反应中需以变性、退火、延伸三种温度为一个循环，因此，设计PCR基因扩增仪就要能精确控制温度，这对PCR反应十分关键。 Taq DNA聚合酶的应用大大提高了PCR的效率，无需在PCR反应过程中反复加入新鲜酶。Taq DNA聚合酶酶促反应最适温度为70～75℃。 最早的PCR是利用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段进行核酸扩增。问题是该酶不耐热，当样品置于高温(94～95℃)条件下时不可逆失活，故在退火及延伸时，需再向反应液中加入新鲜酶以供扩增所需，相当繁琐。 水浴锅控温 以不同温度的水浴锅串联成一个控温体系。 样品与水直接无缝接触，控温准确，温度均一性好，无边缘效应。 体积大，自动化程度不高，需人为干预，更换水浴锅时控温不稳定。 压缩机控温 由压缩机自动控温，金属导热，控温较水浴锅方便，一台机器便可完成整个PCR流程。但 压缩机故障率高，边缘效应及温度overshooting现象严重。 overshooting：升温过程中，由于一些加热元件，比如半导体、金属块本身会积蓄能量，虽然温度探头探测温度到达了设定温度，但这些积蓄的能量仍然会传给PCR体系，造成实际的温度高于设定的温度的现象。 半导体控温 由半导体自动控温，金属导热，控温方便，体积小，相对稳定性好。 缺点：仍有边缘效应，温度均一性尚有欠缺，各孔扩增效率可能不一致，也存在温度overshooting现象。 离心式空气加热控温 由金属线圈加热，采用空气作为导热媒介，温度均一性好，各孔扩增效率高度一致 满