河北农业大学生物分离工程第十章电泳.ppt

第十章 电泳技术Electrophoresis 本章主要知识点 电泳的概念 电泳的基本原理 电泳技术的分类 常用的凝胶电泳技术有哪些？ 电泳装置的基本组成 聚丙稀酰胺凝胶电泳的一般过程 SDS电泳的基本原理及过程 琼脂糖电泳的特点及其应用 等电聚焦电泳的基本原理 双相电泳的概念及其特点 电泳概念 Arne Tiselius——物理化学家、诺贝尔奖金获得者 定义——荷电的胶体粒子在电场中的移动； 电泳的简单原理 蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分子的相互作用。 带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学与化学特性。 电泳迁移率 电泳迁移率（mobility）:在电位梯度E的影响下，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。 其单位是cm2·sec-1 ·V-1 电泳迁移率的不同提供了从混合物中分离不同物质的基础 电泳的大致分类 依据电泳原理，现有三种形式的电泳分离系统 移动界面电泳（moving boundary electrophoresis） 区带电泳（zone electrophoresis ） 稳态电泳（steady state electrophoresis ） 其中区带电泳是目前常用的电泳系统。 区带电泳的主要技术 区带电泳中的常用技术 载体电泳：粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、聚焦电泳 无载体电泳：自由电泳、毛细管电泳 凝胶电泳 作为电泳支持介质必须具有 化学惰性 不干扰大分子的电泳过程 化学稳定性好 均匀 重复性好 电内渗小等特性 凝胶电泳的支持介质： 聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, PAG） 由丙烯酰胺和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下，聚合而成； 琼脂糖凝胶： 从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部分是由1,3连接的β-D-吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水α-D-吡喃半乳糖交替形成的； 丙烯酰胺的聚合 丙烯酰胺的聚合通常是由化学或光化学过程完成的，通常采用过硫酸铵、过硫酸钾或核黄素（引发剂）来引发该过程；以N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）为增速剂。 丙烯酰胺的化学聚合是由过硫酸铵在碱性条件下，产生游离氧自由基引发单体丙烯酰胺成为自由基状态，经过一系列的自由基反应得到的聚合物； 影响聚合的主要因素 引发剂和增速剂的浓度：浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在40~60分钟内完成。 系统pH值：酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳pH值，以获得最佳的聚合结果； 温度：低温下聚合导致凝胶变脆和混浊；适当提高温度可以使凝胶透明而有弹性； 分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气 系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合； 聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应 在使用凝胶介质的电泳中，由于电泳介质具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不仅可以防止对流，而且可以把扩散减到最小。 凝胶中的大分子分离取决于它的电荷、尺寸和形状 凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力（Size sieving capacity），这种现象被称为分子筛效应（molecular sieving effect） 分子筛效应 琼脂糖凝胶的性能、结构与特点 其优点如下： 琼脂糖凝胶孔径较大，0.075%琼脂糖的孔径为800nm，可以分析百万道尔顿分子量的大分子，但分辨率较凝胶电泳低。 机械强度高：可以在浓度1%以下使用； 无毒； 染色、脱色程序简单，背景色较低； 热可逆性； 生物中性：一般不与生物材料结合； 电内渗（EEO）大：对于对流电泳有益 电泳系统的基本组成 电泳槽：是凝胶电泳系统的核心部分，管式电泳槽、垂直板电泳槽、水平板电泳槽 电源:聚丙烯酰胺凝胶电泳200~600V，载体两性电解质等电聚焦电泳1000~2000V，固相梯度等电聚焦3000~8000V 外循环恒温系统:高电压会产生高热，需冷却； 凝胶干燥器:用于电泳和染色后的干燥； 灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子； 电泳转移装置：利用低电压，大电流的直流电场，使凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上，如PVDF膜 电泳洗脱仪：回收样品 凝胶扫描和摄录装置：对电泳区带进行扫描，从而给出定量的结果。 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理： 由于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是多孔介质，不仅能防止对流，把扩散减少到最低；而且其孔径大小与生物大分子具有相似的数量级，能主动参与生物分子的分离，具有分子筛效应。