细菌的分离纯化生化试验以及保种.ppt

项目总览 1、细菌的分离 2、生化试验 3、药敏试验 4、保存 制作: 宋云杰 指导: 薛永康 ;特点： 快速、方便。 分区划线： 适用于浓度较大的样品； 连续划线： 适用于浓度较小的样品；;　　　由接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。 1.倒平板?按无菌操作要求，在洁净工作台或在火焰旁操作，取融化并冷却至不烫手的固体培养基（约500C），倒入无菌培养皿，倒量以铺满皿底为限（15-20ml），平放待其冷却凝固，备用。? 2.划线分离?使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中沾取少量菌样，在相应培养基平板划线分离（如图），划线的方法多样，目的是获得单个菌落。 3.斜面接种? 　3.1取新鲜固体(斜面)培养基，分别做好标记（写上菌名，日期、接种人等），然后用无菌操作方法，把待接菌种接入以上培养基斜面中。? 　3.2接种方法?用接种环沾取少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之”可把培养基划破。? 3.3接种后37℃恒温培养。 ;倒平板技术;（二）微生物的分离方法 1、平皿划线分离法;划线分离; 2、稀释倒平板法和涂布平板法;1、分离培养前应考虑所分离的细菌的特性，选择适合其生长需要的培养基（需氧还是厌氧、营养的要求高还是不高、培养温度等）等。例如：链球菌在普通琼脂不长，要加血清或血液。大肠杆菌和葡萄球菌要求较低，普通的培养基即可生长。? 2、防止污染。分离培养的整个过程要严格无菌操作。培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。? 3、防止接种器械过热，很容易杀死分离培养的细菌，如接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓取细菌材料，应在酒精灯旁凉凉；另外还应注意防止已钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。 　4、平板划线法：划线后有单个菌落，便于观察菌落的形态、溶血性等。方法左手拿琼脂平板，使其与水平面成450角；右手拿铂金耳，使之与水平面平行，靠近酒精灯火焰操作。将接种环于酒精灯火焰中灼烧灭菌，待其冷却后，蘸取欲检材料少许，注意不要划破琼脂，不要划得太疏，以免造成浪费，不要重复划线，以免形成菌苔。 划线方法：方格划线、蛇形划线、区域划线、交叉划线，选择其中一种进行划线。划毕，将接种环烧灼灭菌，于皿底用蜡笔标记被检材料名称及日期，倒转置恒温箱中培养。;(四)显微观察样品的制备;2、染色观察;细菌染色法;涂片;革兰氏染色; 微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。 根据伯杰氏系统细菌学手册查找所需要分离菌的生物化学特性，对所分离菌的进行相应的生化试验进行鉴定;;一、IMVIC试验 吲哚试验；甲基红试验（M.R.试验）；V.P试验；柠檬酸试验（枸橼酸盐利用试验）； 二、糖类发酵试验 三：硫化氢试验 四：硝酸盐培养基 五：氧化酶培试验 六：淀粉水解试验 七：明胶试验 八：尿素琼脂培养基 九：三糖铁琼脂(TSI) 十：触媒试验 十一：Hugh-Leif son培养基 ;生化试验指导方案;生化试验结果记录;1、注意无菌操作 2、防止杂菌的污染 3、配试剂时要准确精准 4、注意留取空白对照 ; ;药敏片的制作;抑菌圈直径（毫米） 敏感度? 20以上 极敏? 15~20 高敏? 10~14 中敏? 10以下 低敏? 0 不敏?二、药物敏感实验判定标准参考表1，多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上为高敏，6—9毫米为低敏，无抑菌圈为不敏;药敏试验结果记录; 1、培养基：根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度合适（约5-6mm）不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP 三甲氧苄氨（甲氧苄啶）的活性。2、细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能