SARS状病毒实时荧光RT-PCR定量检测.pdfVIP

:##9 ；+( （H ）! ! ! ! ! ! ! 生物化学与生物物理进展! ! ,-./ 01-2345/ 01-6378/ ·:9F · !#! 冠状病毒实时荧光#$%’# 定量检测! 陈苏红! 张敏丽! 黄! 坚! 丁! 雨! 伯晓晨! 王升启## （军事医学科学院放射医学研究所，北京 ##$%# ） 摘要! 为建立一种快速、准确、特异的’( 病毒 ()’ 定量检测方法，根据复合探针荧光定量分析原理，对 ’( 病毒核酸进行实时荧光定量(*+,-( 检测. 借助计算机辅助，对’( 病毒基因靶序列以及检测引物和探 针进行了优化筛选；利用体外转录’( 病毒()’ 靶序列，对(*+,-( 反应的镁离子浓度参数进行了优化；比 较*/0123 法、磁珠法、405678 法、煮沸法等9 种方法提取()’ 的检测效果，建立了样本处理方法；通过对构建 的体外转录靶序列模型的检测，对本方法的灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评价，并通过对 9: 例临床标本的检测对本方法的检测效果进行了评估. 通过克隆’( 病毒核酸靶序列并进行体外转录，获得了 长度约; : = 的体外转录 ()’ 靶序列；经优化，荧光 (*+,-( 反应液中的6: ? 浓度以9; # @@23A B 为最好； ()’ 提取方法采用磁珠法效果较好；本方法的检测灵敏度最低可达% 个拷贝的体外转录 ()’ 分子，特异性 ##C ，!D 值的! 值小于%C . 对临床确诊的9: 份’( 病人血清和漱口水标本的检测结果表明，该方法的检 出率为EFC ，与荧光抗体检测法的符合率为E#C . 上述结果表明，该方法建立的荧光定量(*+,-( 技术能够快 速准确、特异、敏感地对’( 病毒核酸进行定量分析，为临床’( 冠状病毒()’ 的检测提供了新的，更为 有效的检测方法. 关键词! 非典型性肺炎，’( 病毒，荧光定量(*+,-( 学科分类号! 4E$ ! ! 近期出现的非典型性肺炎 （’( ）是一种对 平，在’( 冠状病毒感染准确定性的基础上进一 人类危害大，传播速度快且致死率较高的传染性疾 步对病毒感染数量进行精确定量，本方法在已有复 病，目前尚无有效的预防和治疗药物，因此，对非 合探针荧光定量,-( 技术平台的基础上［% G F ］，建 典型性肺炎的早期诊断尤为重要. 早发现非典型性 立了用于()’ 定量检测的实时荧光 (*+,-( 检测 肺炎病情不但可以进行早隔离，及时切断传染源， 方法. 与目前已有的其他方法相比，该方法用于对 而且可以对非典型性肺炎病人早诊断、早治疗，从 ’( 病毒核酸的检测不仅可以对病毒感染数量进 而降低死亡率. 现已确认，一种’( 冠状病毒变 行准确定量，还可以提高检测的灵敏度、精确度及 种为目前流行的非典型性肺炎主要病原体之一，对 可靠性，降低了假阴性和假阳性率. 而且检测过程 该病原体的检测即可以实现对非典型性肺炎的诊 具有高效、快速、成本低等特点，为’( 冠状病 ［ G H ］ 断 . 毒的定性与定量检测提供了更加有效的方法. 目前，’( 冠状病毒检测和诊断技术的研究 () 材料与方法 ［9 ］ 和开发主要有两大类 ：基于病毒抗原+抗体反应 的免疫学方法；针对病毒 ()’ 的核酸检测技术. (* () 材料 免疫学方法通过抗体检测，可以了解病毒感染以及 I)’ 合成试剂均购自美国J378 (7K75/LM 公司， 疾病发生发展进程. 然而，由于抗体在病毒感染到 N’+,M2K7OM2/5@0P0D7、HQ+I5=LR3+-,J 购自-/S5LM7@ 一