免疫印迹杂交.docxVIP

免疫印迹杂交（Western blot）（050302A）1．仪器（1）制胶模具（2）跑胶及转膜装置（3）大小玻板（4）电泳电源（5）电磁炉2．试剂：（1）Tris base、（2）SDS（3）BSA（购自Biotech）（4）Bis-acrylamide（亚甲双丙烯酰胺）（5）Acrylamide（丙烯酰胺）（6）Glycine（7）DTT（8）NaCl（购自BBI）（9）APS（购自Amresco）（10）Tween-20（温州清明化工厂）3．溶液配制：（1）4 × sample Buffer终浓度Stock液10 ml 工作液0.25 M Tris-HCl, pH 6.82.5 M1 ml8 % SDS20 ％4 ml0.2 M DTT1 M2 ml30 % glycerol100 ％3 ml少量的溴酚兰 1 ml／管分装，-20 ℃保存。4 上样缓冲液 0.5 mol/L Tris-HCl (PH 6.8) 2.5 ml 1 mol/L DTT 1 ml甘油 1.5 mlSDS 400 mg溴酚蓝 5 mg混匀后-20C贮存备用。（2）30%储备胶溶液丙烯酰胺（Acr） 29.2 g亚甲双丙烯酰胺 0.8 g 混匀后加ddH2O2，37 C溶解，定容至100 ml，棕色瓶存于4C。（3）分离胶缓冲液1.5 M Tris-HCL (pH 8.8)18.15 g Tris溶于适量的ddH2O2, 用HCL调节pH 8.8，定容至100ml，4C保存。（4）浓缩胶缓冲液0.5M Tris-HCL(pH6.8)6.05g Tris溶于适量的ddH2O2, 用HCL调节pH 6.8，定容至100ml，4C保存。（5）10% SDS称取10 g SDS，加入双蒸水并定容至100 ml，搅拌过夜，置于室温防止析出。（6）10% APS称取0.2 g APS，加蒸馏水2 ml，-20C保存。（7）电泳缓冲液 (Running Buffer，5 )Tris 15 gSDS 5 gGlycine 72 g 调节pH 8.3，定容至1 L临用时用双蒸水稀释成1×，可重复使用3-4次（可根据电泳的速度决定下次是否使用）。（8）转移缓冲液 (Transfer Buffer，5 )Tris 15.15 gGlycine 72 gSDS 2.5 g调节pH 8.1~8.5，定容至1 L，临用时双蒸水稀释，800 ml 1×的转移缓冲液加200 ml甲醇（9）TBST缓冲液（10×）Tris·HCl (pH 7.6) 30.28 gNaCl 80.15 g Tween-20 10 ml 定容至1 L，临用时双蒸水稀释成1×，可重复使用2-3次。（10）封闭液10.5 mg BSA溶于10 ml 1TBST中，搅拌均匀。（11）封闭液210 g 脱脂奶粉溶于 100 ml的1×TBST（12）叠氮钠存储液（13）一抗稀释液4．上样前准备：（1）稀释样本－确定要加的每孔样本体积（l）及上样量（g）－计算样本需要稀释的终浓度－确定每个样本需要稀释的总体积（l），4×上样缓冲液的体积为总体积/4（l）－根据已经测定好的蛋白浓度计算需要的蛋白量（l）－总体积－蛋白量－4×上样缓冲液＝需要加的ddH2O－以下表为例样本编号蛋白浓度样本量4×sampleddH2O体积终浓度加样量加样本量　（ug/ul）llll（g/ul）lgA15.03 14.91 7.57.59 302.50 1230A26.62 6.04 45.96 162.50 1230A33.69 10.83 41.17 162.50 1230A44.33 9.24 42.76 162.50 1230A53.50 11.42 40.58 162.50 1230A65.46 7.33 44.67 162.50 12304．实验步骤：（1）制胶及安装：按照如下方式安装，安装好之后用水加满以检验是否安装正确。（2）做胶及安装：将水倒干净，按照配方配置