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慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册
一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体
分别进行高
纯度无内毒素抽提,共转染293T细胞,转染后6h 更换为完全培养基,培养48
和72h后,分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,病毒上清液通过超离心浓缩
病毒。
二、实验材料
(一)慢病毒载体、包装细胞和菌株
TM
该病毒包装系统为三质粒系统,组成为pspax2, pMD2G,pHBLV 系列质粒。
1、载体信息
1) 慢病毒克隆载体图谱如下:
各载体用途如下表:
1
地址:上海市徐汇区斜土路1175号景泰大厦1503 400-092-0065
实验室:上海市张江高科技园区蔡伦路150号1号楼2楼 021
邮箱:service@
慢病毒生产及使用操作手册
用途 慢病毒载体
过表达 pHBLV-CMVIE-IRES-ZsGreen、
pHBLV CMVIE-Puro
干扰 pHBLV-U6-ZsGreen、 pHBLV-U6-
puro
还有其他荧光标记和启动子混搭载体,以及
其他载体 tet-on系统高表达/干扰系列载体,详情可咨
询公司分子生物学技术工程师。
2) 包装质粒信息如下:
PSPAX2及PMD2G载体图谱和序列信息 (购自addgene)
2、细胞株 293T,慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞,生长培养
基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株 大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞293T细胞的培养
(一)293T细胞的冻存
2
地址:上海市徐汇区斜土路1175号景泰大厦1503 400-092-0065
实验室:上海市张江高科技园区蔡伦路150号1号楼2楼 021
邮箱:service@
慢病毒生产及使用操作手册
随着传代的次数增加,293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止
此类现象的出现,我们需要在开始就对细胞进行大量冻存,以保证实验的稳定性
和持续性。在细胞对数生长期进行冻存,增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液,加入PBS洗去残留的培养基;
2、加入0.25%的胰酶,消化1~2min后,镜下观察细胞变圆,细胞间间隙
加大时,去除胰酶,加入新鲜培养基吹打混匀,移入离心管中。
3、细胞计数,将细胞全部晃下,加入 3mL 37 ℃ 预热的 10% DMEM,
用 10mL 移液管进行吹打,较大力吹打 6-8 次即可,不留死角,之后,将所
有细胞吸出,置于15mL 离心管中,取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL
eppendorf 管中,加 入 450ul10% DMEM,即为 10 倍稀释,混匀,取 1
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