慢病毒生产和使用操作手册.pdfVIP

  1. 1、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。。
  2. 2、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载
  3. 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
  4. 4、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
  5. 5、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们
  6. 6、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
  7. 7、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
慢病毒生产及使用操作手册 慢病毒生产及使用操作手册 一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体 分别进行高 纯度无内毒素抽提,共转染293T细胞,转染后6h 更换为完全培养基,培养48 和72h后,分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,病毒上清液通过超离心浓缩 病毒。 二、实验材料 (一)慢病毒载体、包装细胞和菌株 TM 该病毒包装系统为三质粒系统,组成为pspax2, pMD2G,pHBLV 系列质粒。 1、载体信息 1) 慢病毒克隆载体图谱如下: 各载体用途如下表: 1 地址:上海市徐汇区斜土路1175号景泰大厦1503 400-092-0065 实验室:上海市张江高科技园区蔡伦路150号1号楼2楼 021 邮箱:service@ 慢病毒生产及使用操作手册 用途 慢病毒载体 过表达 pHBLV-CMVIE-IRES-ZsGreen、 pHBLV CMVIE-Puro 干扰 pHBLV-U6-ZsGreen、 pHBLV-U6- puro 还有其他荧光标记和启动子混搭载体,以及 其他载体 tet-on系统高表达/干扰系列载体,详情可咨 询公司分子生物学技术工程师。 2) 包装质粒信息如下: PSPAX2及PMD2G载体图谱和序列信息 (购自addgene) 2、细胞株 293T,慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞,生长培养 基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株 大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞293T细胞的培养 (一)293T细胞的冻存 2 地址:上海市徐汇区斜土路1175号景泰大厦1503 400-092-0065 实验室:上海市张江高科技园区蔡伦路150号1号楼2楼 021 邮箱:service@ 慢病毒生产及使用操作手册 随着传代的次数增加,293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止 此类现象的出现,我们需要在开始就对细胞进行大量冻存,以保证实验的稳定性 和持续性。在细胞对数生长期进行冻存,增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液,加入PBS洗去残留的培养基; 2、加入0.25%的胰酶,消化1~2min后,镜下观察细胞变圆,细胞间间隙 加大时,去除胰酶,加入新鲜培养基吹打混匀,移入离心管中。 3、细胞计数,将细胞全部晃下,加入 3mL 37 ℃ 预热的 10% DMEM, 用 10mL 移液管进行吹打,较大力吹打 6-8 次即可,不留死角,之后,将所 有细胞吸出,置于15mL 离心管中,取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中,加 入 450ul10% DMEM,即为 10 倍稀释,混匀,取 1

文档评论(0)

kehan123 + 关注
实名认证
文档贡献者

该用户很懒,什么也没介绍

1亿VIP精品文档

相关文档