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慢病毒生产及使用操作手册 慢病毒生产及使用操作手册 一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体 分别进行高 纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6h 更换为完全培养基，培养48 和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩 病毒。 二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 TM 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV 系列质粒。 1、载体信息 1) 慢病毒克隆载体图谱如下： 各载体用途如下表： 1 地址：上海市徐汇区斜土路1175号景泰大厦1503 400-092-0065 实验室：上海市张江高科技园区蔡伦路150号1号楼2楼 021 邮箱：service@ 慢病毒生产及使用操作手册 用途 慢病毒载体 过表达 pHBLV-CMVIE-IRES-ZsGreen、 pHBLV CMVIE-Puro 干扰 pHBLV-U6-ZsGreen、 pHBLV-U6- puro 还有其他荧光标记和启动子混搭载体，以及 其他载体 tet-on系统高表达/干扰系列载体，详情可咨 询公司分子生物学技术工程师。 2） 包装质粒信息如下： PSPAX2及PMD2G载体图谱和序列信息 (购自addgene) 2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养 基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株 大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞293T细胞的培养 （一）293T细胞的冻存 2 地址：上海市徐汇区斜土路1175号景泰大厦1503 400-092-0065 实验室：上海市张江高科技园区蔡伦路150号1号楼2楼 021 邮箱：service@ 慢病毒生产及使用操作手册 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止 此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性 和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基； 2、加入0.25%的胰酶，消化1~2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙 加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃ 预热的 10％ DMEM， 用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，将所 有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入 450ul10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 1