第十一章电泳分离技术.ppt

第十一章 电泳分离技术 广泛应用于各个科学领域的新型 分离技术 概述 在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。 1809年俄国物理学家Peiice首次发现电泳现象，他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变浑浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。 1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。 1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白。 第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪； 1948年，获诺贝尔化学奖； 由于早期的电泳仪价格昂贵，分辨率低，易产生对流，因而逐渐发展起了区带电泳。 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。 区带电泳是指在电泳迁移中以一个缓冲溶液饱和了的固相介质作为支持介质，减少外界干扰的电泳技术。 凝胶电泳和等电聚焦电泳由于其明显的优越性，得到了越来越广泛的应用。 电泳分析的特点 各种电泳技术具有如下特点： 凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可以进行定性或定量分析； 样品量极少； 设备简单，可在常温下进行； 操作简单省时； 分辨率高。已被广泛应用于基础理论研究，临床诊断及工业制造等方面。 电泳的分类 1.电泳按其分离原理不同，分为区带电泳、移动界面电泳、等速电泳、等电聚焦电泳等。 ①区带电泳 ②自由界面电泳 ③等速电泳： 需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带相随，分成清晰的界面，并以等速向前运动。 ④等电聚焦电泳： 由两性电解质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH出聚集成很窄的区带。 影响电泳速度的因素 颗粒性质：直径、形状、静电荷。 电场强度：电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快常压：2-10V/cm 溶液性质：电极溶液和蛋白质样品溶液pH、离子强度、溶液黏度。 电渗：液体对固体支持物的相对移动。颗粒运动的方向与电渗方向一致时，加快颗粒的迁移率。反之亦然。 支持介质的筛孔 凝胶电泳 主要介质为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖——筛分作用小，适于大分子物质 聚丙烯酰胺——分离效果好，分辨率高，适于小分子物质 聚丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种利用人工合成的凝胶作为支持介质的区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N－甲叉双丙烯酰胺经过聚合交联从而形成的三维空间凝胶网络。 PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。  PAGE是目前最常用的电泳方法。 凝胶特性 机械性能、弹性、孔径大小等。 T——单体的总百分浓度 C——交联百分浓度 a——丙烯酰胺的克数 b——亚甲基双丙烯酰胺克数 m——体积 聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径取决于总浓度，随浓度的增加而降低。 聚合方式 光聚合：核黄素为催化剂(阳光,日光)，制大孔胶。 化学聚合：制小孔胶。 过硫酸铵 APS (引发剂) N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 TEMED (加速剂) 被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。 琼脂糖凝胶电泳 （一）优点 1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。 4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 6.有热可逆性 （二）缺点 1.易破碎，浓度不能太低。 2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 主要性能指标 电内渗 胶凝温度 熔化温度 凝胶强度 脱水收缩作用 凝胶电泳的应用——常规聚丙烯酰胺电泳 分子筛效应提高了分辨率 各种大分子的分离 研究生物大分子的特性 可保持分离物的生物活性 缓冲系统的选择 pH值由于影响蛋白质的解离，在电泳过程中具有重要作用 离子强度既要起到缓冲作用，同时还需产热少，对电流相对贡献小。一般选用较低的离子浓度。 凝胶浓度的选择在于选择合适的孔径。