尿液中囊泡的提取和鉴定.doc

尿液中exosome的提取和鉴定 exosome的提取 实验准备 试剂：Sigma P2714，三乙醇胺，NaOH，蔗糖，去离子水 耗材：超速离心管50mL，15mL 配制Isolation solution 50 mL 1. 10 mM Triethanolamine（三乙醇胺）（MW 185.7） 0.093 g 2. 250 mM Sucrose（蔗糖）（MW 342.3） 4.28 g 3. 加去离子水 至 45 mL 4. 1 M NaOH 调pH至7.6 ~220 μL 5. 加去离子水 至 50mL 6. 加protease inhibitors day of isolation 3. 5×SDS-Laemmli for Western Blot 50 mL 1. SDS 3.75g 2. Glycerol 15 mL 3. 1 M Tris-HCl， pH 6.8 2.5 mL 4. Bromophenol溴酚蓝 dab 5. DTT 60 mg/mL 6. 去离子水至 50 mL 实验步骤(Pisitkun 2004; Gonzales, Zhou et al. 2010) 1. 将－80℃冻存的尿液取出解冻，涡旋，分装在50mL离心管中。 2.从-20℃中取出Sigma P2714 蛋白酶抑制剂，加入5mL二次水混匀。 3.每50mL尿液中加入625 μL溶解后的蛋白酶抑制剂（12.5 μL/mL Urine）。 4.于4℃，17000 × g 离心15 min。（新鲜尿液25℃离心） （超速离心机型号Hitachi CP 80MX） 5.取上清液置于超速离心管中，装3管，每管分装8mL， 4℃ 200 000 × g离心1 h。（同上新鲜尿液25℃） 6.离心后弃上清，再取17000 × g上清各8mL分置3管中，同上述条件离心。 7.弃上清，3管中各加50μL isolation solution，涡旋混匀30 s，转移到一个1.5 mL Eppendrof离心管中。 8.加1 mL 200 mg/mL DTT 95℃孵育2 min。 9. 将上述溶液转移至高速离心管中，并加入8 mL isolation solution 17000 × g超高速离心10min。 10.弃上清，加50 μL isolation solution溶解沉淀物，在17 000 × g 离心15 min。取上清做1D SDS/PAGE. 11. Bradford 法测蛋白总浓度。 12.按1:4体积比加入5×SDS-Laemmli 缓冲液（含60 mg/mL DTT），涡旋混匀。 13.60℃加热10 min，-80℃保存。（for western blot） 朱墨桃师姐提取exosome方法(Zhu, Li et al. 2012) 1.2,000 g for 10 min at 4 °C ，除去死细胞； 2.取上清，4 °C 10,000 g 离心30 min，除去细胞碎片； 3.取上清，4 °C 110,000 g离心70 min，弃上清； 4.PBS清洗并重新分散，-80 °C保存。 5.microbicinchoninic acid assay (Applygen Technologies Inc, China)测定蛋白含量。 负染电镜分析 （一）实验准备 4% paraformaldehyde 多聚甲醛（in PBS，pH 7.4），1 % Uranyl acetate乙酸双氧铀in dd-H2O，石蜡膜，200 目镍网 （二）实验步骤 将20μL exosomes 小体悬样与4% 多聚甲醛（in PBS，pH 7.4）1：1混匀。 取10μL混合物滴于石蜡膜上，将200目镍网置于液滴中悬浮10min。 用毛边滤纸从侧面吸干多余液体。 在20μL PBS液滴中悬浮5min，重复。 在20μL 去离子水液滴中悬浮5min，重复。 1% 乙酸双氧铀负染液负染1 min，用毛边滤纸从侧面吸干多余液体。 将镍网正面朝上置于滤纸上，在有盖的玻璃皿中干燥15min。 样品准备完毕，进行EM分析。 1D SDS （一）实验准备 储存液配制：