实验五 目的片段的回收.pptx

实验四、目的片段的回收 学习掌握从琼脂糖凝胶电泳中回收DNA片段 一、实验目的 二、实验原理 琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，像NaClO4（高氯酸钠）能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。试剂盒采用经典的硅胶膜技术，其纯化原理是含有目的片段的琼脂糖凝胶溶解后，硅胶膜柱在高盐和低pH值条件下高效可逆的吸附体系中的DNA片段，蛋白及其他杂质不被吸附而被除去，被吸附的DNA片段在低盐和高pH值条件下再被洗脱纯化。 四、仪器设备 五、实验用具 电泳仪 微型电泳槽 紫外透射检测仪 恒温金属浴 冰盒 微量离心管 移液器 手术刀 微量离心管（1.5 ml1） 吸管头若干 三、实验材料 上次实验课Hind III酶切的MP3质粒 六、试剂 琼脂糖 0.5TBE电泳缓冲液 10  载样缓冲液 （loading buffer） GoldView I型核酸染色剂 （10000  ） DNA分子量标准（DNA marker）：Marker III DNA凝胶回收试剂盒（广州东盛生物科技有限公司） 七、实验步骤 1、配制1.5%的琼脂糖凝胶，选择较大的梳子。 2、酶切MP3质粒的电泳分离（使用新的电泳缓冲液）。 3、切取含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶条带（800-900 bp条带）。 4、其余步骤按照试剂盒说明书进行。 试剂盒操作步骤 1、切取含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶条带（切下后切成小块），放入一个称重过的1.5 ml离心管里，称取凝胶的重量近似的确定其体积。 2、按照每100 mg琼脂糖凝胶对应100 l 溶液BD的比例，向离心管中加入溶液BD。 3、55-65℃恒温金属浴上温育凝胶7-10 min，直至凝胶完全溶化，期间需要振荡混合3次。 4、待溶解后的凝胶溶液降至室温时，将其置于DNA纯化柱中，静置2 min。 5、12000 rpm离心1 min，若溶液量大于DNA纯化柱的容积（700 l ），可分两次离心，弃滤液。 6、加入500 l 溶液PE，12000 rpm离心1 min，弃滤液。重复此步骤一次。 7、 12000 rpm离心3 min，以彻底去除纯化柱中的液体。 8、将DNA纯化柱置于新的1.5 ml离心管里，向纯化柱的中央悬空滴加30 l 溶液Eluent（60℃预热），静置2 min， 12000 rpm离心1 min，管底溶液即为回收的目的DNA片段。之后将DNA储存于-20 ℃保存备用。 注意事项 1、电泳时要试用新鲜配制的TBE缓冲液和新配制的琼脂糖凝胶。 2、 挖含目的DNA的凝胶时，尽量减少周围凝胶的带入，提高DNA回收率。 3、切胶时，尽量使用长波长UV（360 nm），且尽量减少DNA在紫外光下的暴露时间，以防DNA损伤。 琼脂糖必须完全融化，以免堵塞柱子，严重影响DNA片段的回收效率。