Stable 电击感受态细胞使用说明.pdfVIP

Stable 电击感受态细胞 Stable Electroporation Competent Cell 编号 名称 规格 北京华越洋 GX2023-100 Stable 电击感受态细胞 10 ×100ul Stable 电击感受态细胞基因型： F proA+B+ lacIq ∆(lacZ)M15 zzf::Tn10 (TetR) ∆(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ∆lacX74 galK16 galE15 e14- Φ80dlacZ∆M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (StrR) rph spoT1 ∆(mrr-hsdRMS -mcrBC) Stable 电击感受态细胞说明： Stable 电击感受态细胞只能用于电击转化，不可用于热激转化。Stable 菌株是NEB 公司开 发的高转化效率菌株，是逆转录病毒/慢病毒载体系统推荐使用的菌株，具有与Stbl2，Stbl3 完全不同的基因型，但是表现出比Stbl2，Stbl3 更优异的性能，特别适合慢病毒或具有末端 重复序列DNA 片段的克隆。基因组含有重组酶recA1 rel A1 突变，可有效抑制长片段末端 重复区的重组，降低错误重组的概率；同时含有核酸酶endA1 突变，避免了提取质粒过程中 核酸酶的污染，大大提高了高纯度病毒质粒的产量和质量。lacZΔM15 的存在使Stable 可用 于蓝、白斑筛选，此菌株具有四环素和链霉素抗性，唯地生物开发的Stable 电击感受态细胞 适用于大质粒的构建或者各种具有末端重复序列的复杂DNA 文库构建，经特殊工艺制作， pUC19 质粒检测转化效率2×1010 cfu/μg DNA。 Stable 电击感受态细胞操作方法： 1. 0.1cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5 分钟，待其沥干水分，正置 5 分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm 以方便盖上杯盖，冰中静置5 分钟充分降温。 2. 取-80℃保存的Stable 电击感受态细胞插入冰中5 分钟，待其融化，加入目的DNA (质 粒或连接产物)并用手拨打EP 管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。 A. 测定转化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的对照质粒 pUC19； B. 对于连接产物，请用乙醇沉淀DNA 后加入适量TE 缓冲液 (10mM Tris HCl, pH7.5; 1mM EDTA)重悬，DNA 浓度不超过 100ng/μl，体积不超过5μl/50μl 感受态。 3. 用200 μl 枪头将感受态-DNA 混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。 4. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐 参数，也可按所用电转仪推荐的参数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入 冰中。 5. 2 分钟后从冰中取出电击杯，放室温，加入700 μl 不含抗生素的无菌S.O.C. 培养基（室 温），用 1ml 枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到50ml 离心管（BD Falcon50ml 锥形 离心管等），向离心管中补加S.O.C. 培养基至5ml。30℃，225 rpm 复苏90 分钟。当质 粒中含有不稳定片段时，30℃培养可降低错误重组的概率，若转化control pUC19 计算转化 效率，则需37℃，225 rpm 复苏60 分钟 6. 5000rpm 离心一分钟收菌，重悬后取 100-200 μl 涂布到含相应抗生素的S.O.C 平板上 （因菌量较大，若全部涂板请选用直径15cm 培养皿2-5 个）。将平板倒置放于37℃培养箱 过夜培养20-24 小时。 Stable 电击感受态细胞注意事项： 1. 对不稳定DNA 片段的克隆或逆转录病毒/慢病毒载体的构建，涂板后平板应在30℃培养， 以减少发生错误重组的概率。 2. 制备高纯度病毒质粒时，应使用新鲜转化的平板接菌，新鲜菌液提取质粒，菌液不可低温 保存后提取质粒。 3. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化。插入冰中 10 分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时 间过长，长时间存放会降低转化效率。混入目