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3、无菌技术 (1)消毒和灭菌的区别 条件 结果 常用的方法 消毒 较为温和的物理或化学方法 仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子) 煮沸消毒法（100度5-6分钟）、巴氏消毒法（70-75度30分钟或80度15分钟）、紫外线或化学药物消毒法 灭菌 强烈的理化因素 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 灼烧灭菌（接种环或阵酒精灯外焰）、干热灭菌（干热灭菌箱160-170度1-2小时）、高压蒸汽灭菌（高压蒸汽灭菌锅100KPA，121度15-30分钟） (2)无菌技术具体操作 ①对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。 ②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 ③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 ④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 4、纯化大肠杆菌以及菌种的保藏 (1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。 (2)纯化大肠杆菌 ①原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。 ②方法：平板划线法、稀释涂布平板法。 (3)菌种的保藏 ①短期保存：固体斜面培养基上4℃保存，菌种易被污染或产生变异。 ②长期保存：－20℃甘油管在冷冻箱中保藏。 一、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1．选择合适的培养基 (1)根据培养基的用途可分为选择培养基和鉴别培养基，这部分内容中既用到选择培养基又用到了鉴别培养基。 两个实验通过分别用尿素为唯一氮源、纤维素为唯一碳源的选择培养基进行筛选。实验后分别用酚红指示剂显红色、刚果红指示剂出现透明圈来鉴别两种细菌。 2．统计菌落数目的方法 (1)显微镜直接计数法----直接计数法 ①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。 ②方法：用计数板计数。 ③缺点：不能区分死菌与活菌。 (2)稀释涂布平板法----间接计数法(活菌计数法) ①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长着一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 操作注意： a．设置重复组，增强实验的说服力与准确性。 b．为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。 计算公式：每克样品中的菌株数＝C/V×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。 3．细菌分离与计数的实验流程 土壤取样→样品稀释→取样涂布→微生物培养→观察并记录结果→细菌计数。 4.对目的菌的鉴定 在细菌分解尿素的反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。氨会是培养基的碱性增强，在培养集中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红。 二、分解纤维素的微生物的分离 1．纤维素酶是一种复合酶，它包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。 2．纤维素分解菌的筛选原理 (1)刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。 (2)纤维素分解菌能产生纤维素酶分解纤维素，从而使菌落周围形成透明圈。 3．土壤中纤维素分解菌的筛选 (1)方案 土壤取样→选择培养（根据目的菌数量而定）→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。 (2)选择培养的目的：增加纤维