ELISA)在药物残留检测-深圳市宝安康生物技术有限公司.ppt

酶联免疫技术（ELISA) 深圳市宝安康生物技术有限公司 技术中心 常用的检测方法 ------微生物法 常用的检测方法 ----物理化学法 1、如液相色谱(HPLC) 、气相色谱(GLC) 、质谱 (MS) 、薄层色谱法(TLC) 等，可用于鉴定和 定量。 2、优点：分离度好、专属性强，常常可以同时测 定几种药物。 3、缺点：需要专门仪器和熟练技术的分析人员，而且需要复杂的样品前处理和高纯度的化学试剂。由于样本前处理设备多、测定操作烦琐和费用高，在基层实验室推广和使用受到限制。因而检测大批样本较为困难。 常用的检测方法 -----生物芯片法 1、生物芯片（biochip）是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量抗原等有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器，比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量. 2、主要特点是高通量、微型化和自动化 ，因涉及技术和仪器问题，目前还不能普及应用． 常用的检测方法 -----酶联免疫测定法 1、将抗原与抗体反应和酶化学反应结合到一起的 测定技术，近年来已研发出多种ELISA检测试 剂盒用于检测动物组织中的药物残留。 2、具有灵敏度高、快速、特异性强的特点，所需 仪器化程度低和样本前处理相对简单，特别适 于现场监控和大量样本筛查。 3、现用于兽药残留检测的试剂盒，如国外德国 R-Biopharm，国内深圳绿诗源、北京望尔等。 ELISA的类型 一、双抗体夹心法：测抗原 （成正比） 双抗原夹心法：测抗体（成正比） 二、间接法：检测抗体常用的方法。 （成正比） 三、竞争法：测抗体 （成反比） 竞争法：测抗原 （成反比）　 　 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。 ELISA主要的仪器设备 1、酶标测定仪、通风柜 2、洗板机或洗涤瓶、恒温培养箱、冰箱 3、低温离心机、离心管 4、氮气吹干仪、真空泵 5、均质器、振荡器 6、刻度移液管、天平（感量0.01g ） 7、微量移液器：单道0.5-10ul,20-200ul, 100-1000ul，多道50ul-300ul ELISA常用有机试剂 乙酸乙酯、乙腈、正己烷、磷酸氢二钾、 磷酸二氢钾、Na2HPO4·12H2O、浓HCL、 NaH2PO4·2H2O、NaOH、蒸馏水 样本前处理操作对结果 的影响因素 样品的取样和提取 —— 提取 1、震荡：充分混匀、震荡；在规定时间内充分提取。（提取不完全会造成假阴性，检测不出阳性值） 2、离心：离心分离时，按要求转数离心，若达不到离心 转数则要求增加相应的离心时间，最终达到分离的目 的（离心不彻底，上清浑浊会造成假阳性） 3、取液：在有两相以上分离时，取目的相一定注意不能 带入其它相（枪头靠壁吸取）。随机带入的其它相越 多，假阳性/假阴性也将越高。（注意：用加样器取有 机溶剂时，应注意避免交叉污染） 宝安康ELISA试剂盒基本原理 —— 间接竞争法 原理： ----竞争法原理是固相抗原、待检抗原与特异性抗体竞争结合，加入酶标二抗放大信号后，加入底物液显色，标本中抗原越多，与特异性抗体结合得越多，颜色越浅，反之越深，因此根据颜色深浅可以进行定量测定也可目测进行定性测定。 ELISA基本的实验过程 1、包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附 到固相载体表面，使抗原或抗体固相化 2、抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶 结合物，使之与固相抗原或抗体发生免 疫反应而被结合固定 3、酶促反应：在反应体系中加入酶作用的 底物，使发生酶促反应而显色 ELISA基本的实验过程