PCR与DNA提取一般方法.ppt

PCR原理+流程; PCR原理;特点;用途;(1)扩增各种蛋白的基因： (2)PCR后的测序：可以很快地测出常规的PCR产物或单链的DNA序列 (3)用于分子进化和种系发育的研究，研究其分子进化及种系发育是很有用的 4)分析和诊断遗传性疾病 (5)对人类HLA基因的多肽性分析，对于某些基因突变，如肿瘤发生的研究等均很有用。;主要过程; 模板DNA的变性;模板DNA与引 物的退火(复性);引物的延伸;PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 ;PCR扩增物; 所需材料;3)耐热的DNA 聚合酶： ① Taq DNA 聚合酶是从表达克隆嗜热水生菌的DNA 聚合酶基因的大肠杆菌提纯而来。此酶有5’→3’ DNA聚合酶和5’→3’外切酶活性，但是缺乏3’→5’ 外切酶活性。 ② rTth DNA聚合酶是Thermus thermophilus(Tth)和Thermococcus litoralis(Tli)两种菌中耐热DNA聚合酶的混合。这种混合酶特别具有5’→3’DNA 聚合酶和3’→5’外切酶(校正)的双重活性。当按推荐量使用时，此酶可提高保真度及长链PCR的产量。;(4)琼脂糖凝胶 (5)10 μM的上游和下游引物 (6)DNA模板 (7)对照DNA(含有靶序列的DNA) (8)DNA长度标准参照物;2. 设备;(2)可预先设定扩增方案的温度循环器(PCR仪);实验操作;;;;6．72oC温育PCR样本10分钟，可于4oC维持。样本可贮存于-20oC直至使用。 7．采用琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应产物，溴化乙锭染色显影DNA，用合适分子量标准的DNA作参照。; 电泳; PCR荧光定量; 结果;;植物DNA提取方法;乌桕DNA提取方法; CTAB法提取植物基因组DNA;一 材料、试剂和仪器;2 试???;;3. 仪器:;b、恒温水浴;c、电泳装置;实验步骤;3.加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下10 000rpm离心10 min，移上清至另一新管中。 4.向管中加入1/100体积的RNase A溶液，置37℃20-30min。5.加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20℃放置30 min或-80℃放置10min，12 000rpm离心10-15min回收DNA沉淀。 6. 用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌ddH2O中。 7 .0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。; SDS法; 试剂;(2)裂解液20%SDS (3)高盐溶液5mol/L KAc (4) RNaseA 10mg/ml (5) 异丙醇 (6)灭菌ddH2O或TE; 实验程序;4 、4℃,15 000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中，加入0.7V的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30 min 。 5 、12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。 6 、加入1/10体积的RNaseA，37℃保温20min，除去RNA 7 、CI抽提后，加2V乙醇，-20℃沉淀30 min 。12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。 8 、用400μL 70%乙醇洗一次后，吹干，加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。;9 、电泳检测完整性。; 国内外相关文章; 乌桕基因组DNA提取方法研究;;