【2017年整理】10-AKP活性检测27日.pptVIP

QA 关于噬菌体污染;表达产物AKP蛋白的检测;AKP,大肠杆菌碱性磷酸酶 (大肠杆菌碱性磷酸酯酶，EC.3.1.3.1) 在碱性环境下:水解多种磷酸单酯化合物 需要镁和锰离子为激活剂;沉降系数(单体);;1、酶活测定：底物显色法;1、酶活测定：底物显色法;实验操作;1. 菌体加入15mL匀浆液 2. 超声破碎： 输出功率1200w，超声2秒， 间隔10秒，超声次数：40次 3. 粗匀浆制样： 细胞破碎液 200uL ＋ 4x 样品处理液100uL + 匀浆缓冲液100uL 90℃变性5min，室温保存准备SDS电泳用。 4. 匀浆上清制备：另取1.0 mL细胞破碎液，4℃, 12000rpm×10min离心，留上清液 5. 上清液制样：匀浆上清 200uL ＋ 4x 样品处理液100uL + 匀浆缓冲液100uL ，90℃变性5min，室温保存准备SDS电泳用。;组别;谢谢！;自然胶电泳； 变性胶电泳 等电聚焦 梯度胶电泳 印迹转移电泳 双向电泳;丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺;SDS的 浓 缩 效 应;Gly－ 、 Pr－ 、Cl－;SDS的变性作用;实验操作;1. 洗净胶板，架好和固定好胶板2. 配置12%分离胶（20mL）3. 分离胶混匀后用5mL枪头加入两玻 璃夹缝中，并小心在胶面上加入 1cm蒸馏水，37℃约20－40min后胶自然凝聚4. 配制4%浓缩胶（10mL），浓缩胶混匀后，迅速倾斜倒出蒸 馏水，将浓缩胶加入两玻璃夹缝5. 在两玻璃板夹缝中垂直插入1.5mm的梳子，浓缩胶凝固后将凝胶装入电泳槽，在槽中加入1×SDS电极缓冲溶液，小心拔出梳子;1). 电泳加样： 将制备好的样品点甩离心后， 按顺序向胶孔中加入适当体积的蛋白样品（20uL-30uL）和分子量Marker（10uL）。 （注意：同时进行顺序和样品完全一致的两组胶的电泳，以备分别进行染色和Western blotting分析） 2). 电泳： 浓缩胶部分电泳条件：80V恒压电泳； 分离胶部分电泳条件：120V恒压电泳。 当溴酚蓝移动到前沿时，切断电源，停止电泳 从电泳槽中取出胶板，小心剥离凝胶，并将凝胶切成两部分。 其中：一部分用R250染色、脱色和观察结果 另一部分准备免疫印迹;1). 染色： 将胶置于20mL的R250染色液中染色2h 3). 脱色： 将胶转移至20mL的脱色液中脱色1.5h，以目的条带清晰显示为准 3). 观察结果： 凝胶成像仪照相并保存结果 4). 胶的保存： 将胶转移至20mL的保存液中，可常温保存很长时间。;空载体;谢谢！; 印迹(blotting)是70年代中后期出现的一种生化技术 印迹类似于吸墨迹的过程 它常需要和各种凝胶电泳、转移、固定化、分子杂交及许多灵敏的检测技术相匹配而进行 广泛应用于DNA、RNA、蛋白质、抗原、受体糖蛋白等多种生物大分子的研究 电泳 转膜 固定/封闭 抗体结合 检测;　;1）印记方式： 虹吸作用转移 电转移 真空转移 斑点/狭缝印记;　印迹在NC膜上的特异抗原的检出依赖于抗原抗体亲和反应。一般经过封闭、一抗结合、二抗结合、显色等步骤。一抗对抗原是特异的。酶标二抗是商品化的，对某种动物的一抗都可以反应。 　二抗常用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素、生物素、同位素等标记。辣根过氧化物酶的底物有DAB（二氨基联苯氨），OPD(邻苯二氨）等;膜;实验操作;P1:凝胶电泳 P2:转膜(印记）P3:封闭 P4:结合一抗 P5:结合酶标二抗 P6:显色;1. 另一部分凝胶、滤纸和硝酸纤维素膜分别在转移缓冲液中浸泡至少30分钟（甲醇的作用） 2. 正极上铺三层和凝胶一样大小的滤纸，??后依次将硝酸纤维素（NC）膜和凝胶铺在滤纸上，再在凝胶上铺三层滤纸，吸干“三明治”样结构周围的印迹缓冲液，并压上负极（注意不要有气泡） (短路与断路) 3. 恒流1.0mA/cm2转移1.5hr 4. 转移结束后将NC膜取出，凝胶继续用R250染色以便分析转移的完全程度 5.NC膜至于5%脱脂奶粉中，4度封闭一周，待用。;6. 一抗结合：倒去封闭液， 加入一抗（ 1xPBS 按1：100稀释） 370C轻轻摇动，孵育60min 7. 漂洗：1xPBS清洗3次(每次漂洗5min) 8.二抗结合：按 1：1000稀释二抗（偶联辣根过氧化物酶） 370C轻轻摇动，孵育60