第二节 蛋白质的生物合成、修饰和分泌2015.ppt

甲醇营养型酵母表达系统 　　 甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中，大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因—1(AOX1)，在该基因的启动子(PAOX1)作用下，外源基因得以表达。甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源，诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞，不会发生超糖基化。 　 ⑵丝状真菌 优点：分泌能力强，能正确进行翻译后加工（肽剪切糖基化）有成熟的发酵和后处理工艺。 昆虫表达系统 昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统，它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。它具有真核表达系统的翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；其最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；可表达非常大的外源性基因(一200kD)；具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力；对脊椎动物是安全的。 哺乳动物表达系统 哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染。利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。哺乳动物细胞表达载体必须包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等控制元件。 根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为瞬时、稳定和诱导表达系统。瞬时表达系统是指宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养，载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失，目的蛋白的表达时限短暂；瞬时表达系统的优点是简捷，实验周期短。稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培养，载体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达持久、稳定。由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤，稳定表达相对耗时耗力。诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱导后才得以开放。采用异源启动子、增强子和可扩增的遗传标记，可提高蛋白产量。 哺乳动物表达系统在蛋白的起始信号、加工、分泌、糖基化方面具有独特优势，适合表达完整的大分子蛋白。由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质，但构成复杂、操作技术要求高、表达产量不大、产率低，且有时会导致病毒感染等是该表达系统的不足之处。 植物表达系统 植物能够表达来自动物、细菌、病毒以及植物本身的蛋白质易于大规模培养和生产，且在基因表达与修饰及安全性方面有特别的优势，因此利用植物生产外源蛋白质的研究展现了极其诱人的前景。多种抗体、酶、激素、血浆蛋白和疫苗等都已通过基因工程的手段在植物的叶、茎、根、果实、种子以及植物细胞和器官中得到表达，然而提取与纯化始终是大规模利用植物生产重组蛋白的主要障碍。 表达系统 优劣 产量 适用 大肠杆菌 具有良好的可操作性，成本低，但不能进行糖基化修饰，胞内易形成包涵体。 外源蛋白10%—70%胞内表达，0.3%—4%胞外表达 抗体片段以及表达产物翻译后的有无不会影响其活性的蛋白类药物。 酵母 兼具原核细胞良好的可操作性和真核系统的后加工能力。 外源蛋白占菌体总蛋白的10%—30%。 对蛋白结构有一定的要求 ，如牛凝乳酶、人血清蛋白。 昆虫细胞 具有高等真核生物表达系统的优点，产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似。 外源蛋白最多可占菌体总蛋白的50%。 适用于大部分蛋白。 哺乳动物细胞 产物的活性和功能与天然蛋白质最接近，糖基化等后加工最准确，但表达水平较低，成本较高。 很少 对蛋白结构要求较高，分子较大，结构复杂的蛋白。 转基因植物 经济实用，成本低，表达产物能进行正确的折叠，但产物的分离纯化难。 较高，可达总蛋白的3%—5%。 大分子量的蛋白，特别是药用蛋白。 转基因动物 产物易提纯，可进行必要的修饰，且产物具有生物活性，但转基因动物成活率低，遗传困难。 表达水平低 表达药物蛋白及具有生物活性的蛋白。 * * * * 组蛋白密码子 最为重要的肿瘤抑制分子p53 蛋白质的一级结构和它的三维构象以及生物功能的直接关系一直是现代生物化学研究的重点。这方面的一个经典范例是Christuian Anfinsen在1950年后期做的牛胰RNase复性实验。 变性的牛胰核酸酶在适当的条件下能重新折叠成天然的生物活性的状态，这暗示：如果已