hTERTshRNA表达质粒的构建和鉴定.docVIP

hTERT shRNA表达质粒的构建及鉴定 胡凡果1，史玉荣2，牛瑞芳2，刘彤1，只向成3 （1 天津医科大学总医院普通外科 300000；2天津医科大学附属肿瘤医院中心实验室300000；3天津医科大学附属肿瘤医院乳腺三科 300000） 通讯作者：只向成 doctorx888@ [摘要] 目的 构建针对人端粒酶催化亚基hTERT的shRNA表达质粒并加以鉴定。 方法 以具有G418抗性的pBAsi-hU6-Neo（BamHI/HindⅢ）质粒构建针对hTERT的shRNA表达载体，应用基因测序加以验证。经脂质体转染shRNA质粒入乳腺癌T47D细胞，抗生素G418筛选转染成功的细胞株。采用半定量RT-PCR及western blot法检测细胞中hTERT在mRNA和蛋白质水平上的表达；TRAP-ELISA法检测细胞的端粒酶活性变化。结果 成功构建了5种针对hTERT的shRNA质粒，经测序验证无误。将质粒转染入T47D细胞后经G418筛选获得了稳定转染的细胞株，hTERT基因在mRNA和蛋白水平的表达明显降低，端粒酶活性显著下降。 结论 质粒pBAsi-hU6-Neo（BamHI/HindⅢ）可用于构建hTERT shRNA表达载体,可转染到乳腺癌T47D细胞，并能显著降低hTERT基因mRNA和蛋白的表达，进而抑制细胞端粒酶活性。 [主题词] 端粒酶；人端粒酶逆转录酶；