荧光定量PCR原理及应用(科研版).ppt

实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR三个关键词： 实时，荧光，定量 如何实时检测？？？ 借助荧光物质示踪扩增产物量的变化 实时荧光定量PCR原理 在PCR反应加入能示踪扩增产物的荧光化学物质，随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图，从而通过荧光强度变化实时监测产物量的变化 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析 引入两个概念： 荧光阈值、Ct值 实时荧光定量PCR原理 定量原理 Ct值的概念 Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数 实时荧光定量PCR原理 定量原理 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 实时荧光定量PCR原理 阈值的选择 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 实时荧光定量PCR原理 为什么要用Ct值定量 实时荧光定量PCR方法利用Ct的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。 实时荧光定量PCR原理 示踪扩增产物量变化的荧光物质及其工作原理 MJR系列实时荧光定量PCR仪之 SYBR Green I 融解曲线分析 Chromo 4四通道实时荧光定量基因检测系统之 四通道检测 Chromo 4四通道实时荧光定量基因检测系统之 高分辨率 可以清晰的分辨出128、256、512、1024拷贝数的初始模板量 Chromo 4四通道实时荧光定量基因检测系统之 优越的重复性 无论使用哪一个通道，无论使用非特异性的SG1 或特异性的TaqMan 探针，都能得到重复性极好的结果 材料和方法 材料 从 正常乳腺组织中提取的 Total RNA 从乳腺癌组织中提取的 Total RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线 单双通道同时进行，独立分析 Controls no RNA RNA + no reverse transcriptase 材料和方法 RT-qPCR 材料和方法 RT-PCR RT-qPCR program 1,50oC,30min 2,95oC,15min 3,94oC,15sec 4,60oC,1min 5,plate read 6,go to step 3,39 more times 7,10oC,forever End 实验结果 单双通道相互验证 讨论 成功检测 Opticon 实时荧光定量PCR仪之 实验结果（2） 实验时间： 2002年8月14日 地点： 北京红十字血液中心 试剂： PG公司 HIV试剂盒 样本： 血液中心-20度保存 Opticon 实时荧光定量PCR仪之 实验结果（3） 实验时间： 2002年8月21日 地点： 北京大学生命科学学院 试剂： PG公司 HBV试剂盒 样本： 参控标准品 Opticon 实时荧光定量PCR仪之 SARS试剂盒实验结果 Opticon 实时荧光定量PCR仪之 实验结果（ERBB2检测） Opticon 2 实时荧光定量PCR仪之 实验结果（双色分析） Opticon 2 实时荧光定量PCR仪之 实验结果（线性范围） Opticon 2 实时荧光定量PCR仪之 实验结果（线性范围与重复性） Opticon 2 实时荧光定量PCR仪之 实验结果（2倍分辨率） MJR系列实时荧光定量PCR仪之 OUTLINE 实时荧光定量PCR原理 荧光定量PCR仪简介 实时荧光定量PCR在科研上的应用 实时荧光定量PCR实验设计实例 实时荧光定量PCR技术之 应用 定量： DNA定量 RNA定量 定性： SNP分析 基因型分析 RNA变异分析 融解曲线分析 临床定量研究