乙酰肝素酶的表达与肝癌侵袭转移及预后的关系论文.docVIP

　　乙酰肝素酶的表达与肝癌侵袭转移及预后的关系论文 【摘要】 目的 探讨乙酰肝素酶（Heparanase Hpa）在肝癌中的表达及其与肝癌临床病理特征的关系。方法 分别采用RTPCR和免疫组织化学法检测Hpa mRNA及Hpa蛋白在肝细胞肝癌、癌旁肝组织及肝癌细胞株中的表达。结果 肝癌Hpa mRNA的表达显著高于癌旁及正常肝组织（P 0.05），肝癌组织中Hpa mRNA的表达与肿瘤包膜受侵、门脉受侵、肝内转移、TNM分期、复发有关（P 0.05）。肝癌Hpa蛋白的表达与包膜和门脉是否受侵、Edmondson分级、有无肝内转移、TNM分期及复发有关（P 0.05）。结论 Hpa mRNA及蛋白在肝癌中高表达，并与肝癌的侵袭转移、复发、预后有关。 【关键词】 肝细胞肝癌 乙酰肝素酶 侵袭 转移 复发 0 引言 乙酰肝素酶（heparanase，Hpa）是1999年克隆分离出的一种葡糖苷酸内切酶1。它可以降解硫酸乙酰肝素 (hearan sulfate，HS)，破坏细胞外基质和血管基底膜，并促进肿瘤新生血管生成，使肿瘤细胞实现侵袭转移。我们运用RT-PCR和免疫组织化学法对Hpa mRNA及Hpa蛋白在肝细胞肝癌、癌旁肝组织及肝癌细胞株中的表达进行了检测.freel处肝组织。另取手术治疗的良性疾病的正常肝组织10例作对照。标本切除离体后一份立即投入液氮中，置于-70℃冰箱保存备用，另一份用10％的福尔马林固定。病人随访2年以上，其中23例复发，1例死于其他疾病。本组病例男性36例，女性7例。年龄36～72岁，平均52.7岁；HBsAg阳性者37例。病理学分级根据Edmondson方法，分期按国际抗癌联盟于1997年提出的TNM分期方案。 1.2 主要试剂 Trizol试剂（美国Gibco BRL公司），DNTPs、AMV、TaqDNA 聚合酶由华美公司提供，内参照及随机引物由上海生工生物工程公司合成。Hpa兔抗人多克隆抗体购自Santa Cruz公司，SP试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。人肝细胞癌细胞株SMMC7721细胞、BEL7402细胞由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供。 1.3 细胞培养方法 用RPMI1640培养基在含有5％ CO2、37℃恒温培养箱中分别培养人肝细胞癌细胞株SMMC7721和BEL7402细胞，常规传代，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，离心10min（1 000r/min），10mol/L PBS洗细胞两次后，收集细胞用于提取总RNA。 1.4 总RNA提取 参照Trizol试剂说明书提取组织及细胞总RNA，然后在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，将凝胶移至紫外透射仪下，在300nm紫外光线照射下进行观察，验证RNA的完整性，并在紫外分光光度仪上测260nm和280nm两个波长的吸光度，进行RNA的定量。 1.5 半定量RTPCR检测 Hpa引物序列上游为5'TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC3'，下游为5'GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC3'，其扩增片段长度为585bp。以βactin作为内参照，其引物序列上游为5'ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG3'下游为5'CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC3'，其扩增片段长度为838bp。Hpa的反应条件为反转录37℃ 60min；预变性94℃ 5min；变性94℃ 1min；复性57℃ 1min；延伸72℃ 1min。进行35个循环后进一步延伸72℃ 5min。取10μl产物于1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，通过凝胶扫描仪（美国FOTODYNE公司）进行cDNA电泳条带和光量子强度分析，将Hpa与βactin比值作为Hpa表达水平的参数。 1.6 免疫组织化学染色方法及结果判定 标本常规甲醛固定取材、脱水、石蜡包埋后做4μm连续切片，按SP免疫组织化学染色试剂盒染色步骤进行，Hpa表达阳性为细胞浆染成棕黄色，在光镜下观察5个高倍视野，计算阳性细胞数，阳性细胞数≤10％为阴性表达， 10％为阳性表达。 1.7 统计学处理 采用t检验及χ2检验，由SPSS10.0软件进行处理。 2 结果 2.1 Hpa在不同组织中的表达 43例肝癌组织中有26例（60.5%）Hpa mRNA阳性表达，43例癌旁组织中仅2例（4.7%）阳性表达；免疫组织化学染色显示25例肝癌组织Hpa 蛋白表达阳性，癌旁组织有5例表达阳性；10例正常肝组织均未见表达；肝癌与癌旁、正常肝组织的Hpa mRNA及蛋白表达差异有显著性（P 0.05）；人肝癌细胞株SMMC7721及BEL7402细胞Hpa m