GCNF在宫颈癌细胞中的表达及其作用初探.pdf

摘 要 目 的：观察 GCNF 基因在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌组织以及体外培养宫颈癌细胞系 （HeLa 细胞）中的表达。构建人pcDNA3.1–GCNF 真核表达载体，研究GCNF 基因重组质粒表达产 物对体外培养宫颈癌细胞增殖、凋亡、黏附和侵袭力的影响。 方 法：（1）收集我校一附院病理科正常宫颈、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌 （鳞癌）组织蜡块，并体 外培养HeLa 细胞，用免疫组织化学SP 法观察 GCNF 基因在上述组织、细胞中的表达。（2 ）采用 PCR 的方法从pMD18–T-GCNF 载体中扩增全长GCNF cDNA, 酶切扩增产物及pcDNA3.1(-)载体质 粒，酶切产物电泳回收后进行定向连接，构建 pcDNA3.1-GCNF 重组质粒，连接产物转化感受态大 肠杆菌DH5 α,进行菌落PCR 鉴定。扩增后提取重组质粒DNA 进行PCR 鉴定并制成甘油菌送往公 司测序；（3 ）脂质体介导法瞬时转染重组质粒至宫颈癌HeLa 细胞，RT-PCR 以及间接免疫荧光鉴定 转染结果；（4 ）倒置显微镜观察转染前后细胞形态的变化；MTT 法检测转染前后细胞增殖的变化； Annexin V-PI 双染流式细胞术分析转染前后细胞凋亡情况；基质黏附实验观察转染前后细胞黏附情 况；Transwell 侵袭实验检测转染前后细胞的侵袭能力。 结 果：1.正常宫颈GCNF 呈强阳性表达；CIN Ⅰ中GCNF 呈阳性表达；CIN Ⅱ中只有个别细胞表 达GCNF ；CINⅢ中GCNF 不表达；宫颈癌组织中GCNF 不表达；HeLa 细胞中GCNF 不表达；2. PCR 凝胶电泳在1450bp 附近得到目的条带，经双酶切后与载体质粒连接得到pcDNA3.1-GCNF 重组质粒， 转化到大肠杆菌并经菌落PCR 筛选得到单克隆菌株，抽提质粒DNA 并经质粒PCR 鉴定后测序，与 基因库中登录的GCNF 序列比较，符合率99.99%；3. 阳性重组质粒脂质体法转染HeLa 细胞，RT-PCR 凝胶电泳显示转染目的基因后在200bp 附近可见一条明亮的目的条带，其灰度比值（98.82±0.79 ）% 明显高于未转染组和转染空质粒组（9.67±0.29 ，10.29±0.59 ）% ，差异有统计学意义（P0.05 ）；间 接免疫荧光结果显示，转染目的基因后，大部分 HeLa 细胞的 GCNF 呈阳性表达，转染空质粒和未 转染组HeLa 细胞无GCNF 表达；4.转染后细胞形态无明显变化；MTT 结果显示，转染目的基因后 HeLa 细胞光吸收值最大（0.239±0.011 ），高于未转染组和转染空质粒组（0.203±0.009，0.196±0.016 ） （P0.05 ）；流式细胞仪检测凋亡细胞，显示转染目的基因后细胞凋亡率最低为 11.46% （P0.05 ）， 空质粒和未转染组的凋亡率分别为16.5%和 15.34%；同样的干预条件用基质黏附实验检测细胞迁移 率，和Transwell 侵袭实验检测细胞侵袭力，发现各小组之间没有明显差异。 结 论：(1)GCNF 基因在正常宫颈组织中高表达可能与上皮细胞的正常分化有关；(2)首次观察到 GCNF 基因在 CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、CINⅢ中表达由强变弱至宫颈浸润癌表达完全消失，提示GCNF基因 可能未参与宫颈上皮细胞的异常分化或恶性分化；(3)GCNF 基因在宫颈浸润癌以及体外培养 HeLa 细胞中不表达提示GCNF 基因可能作为宫颈癌的一个早期诊断指标；(4)成功构建了pcDNA3.1-GCNF 真核表达载体，并瞬时转染入宫颈癌HeLa 细胞；(5)GCNF 过表达可促进了体外培养的HeLa 细胞的 增殖，同时也可抑制其凋亡，而对 HeLa 细胞的黏附和侵袭没有影响。(6)本研究结果对宫颈癌早期 诊断以及宫颈癌发病机制等提供参考。 关键词：GCNF ；宫颈癌；转染；增殖；凋亡；Transwell 侵袭实验 论文类型：A （基础研究） I Abstract Objective: To observe the expression of GCNF gene in normal cervix, cervical intraepithelia