Zfy基因干扰对小鼠性别控制的研究.pdf

Zfy 基因干扰对小鼠 Y 精子生成的影响 摘 要 睾丸是雄性最重要的生殖腺，它是雄性激素分泌及精子发生的场所。Zfy基因位于Y 染色体的短臂上，与精子的形成与发生相关，作为一个较强的转录激活因子，引导靶基 因穿过核膜，定位于精子细胞核内，可能对精子变态过程中的某些基因具有转录激活作 用。本研究根据Zfy基因特点，设计shRNA片段，进行Zfy基因的RNAi实验，采用RT-PCR 分析干扰后Zfy基因的mRNA表达水平，并统计经干扰后子二代的性别比例。具体研究结 果如下： 1.根据Gen Bank提供的小鼠Zfy基因mRNA序列，针对该基因的编码区，设计并合成 了shRNA干扰片段。以Ambion公司pSilencer5.1-H1 Retro为载体，构建小鼠靶向Zfy基因 的shRNA表达载体pSilencer5.1/Zfy215及pSilencer5.1/Zfy2102 ，经酶切和序列测定证实， 实验所构建的表达载体中含有设计合成的干扰序列，且插入序列的位置及方向均正确， 上下游表达调控元件完整。说明两个shRNA表达载体构建成功，可以用于小鼠Zfy基因干 扰实验。 2.将构建的两个Zfy基因siRNA重组表达载体进行小鼠体内RNAi 的研究。选取64只雄 鼠随机分成四组（每组16只），第一组、第二组为试验组，分别注射重组质粒p215与p2102 ， 第三组与第四组作为对照组，分别注射同等体积的空载体pSilencer5.1-H1 Retro及生理盐 水。间隔10天注射一次，连续注射4次。最后一次注射17d后，每组8只雄鼠按1:1与雌鼠 交配，另外8只采集睾丸组织，利用荧光实时定量PCR法检测Zfy基因mRNA 的表达水平。 结果表明，pSilencer5.1/Zfy2102干扰后Zfy基因的mRNA表达水平与对照组差异极显著 (P0.01) 。繁殖试验表明后代雌鼠率达到72.3% ，极显著高于对照组(P0.01) 。 pSilencer5.1/Zfy215干扰后，Zfy基因的mRNA表达水平与对照组差异显著(P0.05) ，后代 雌鼠率与对照组无显著差异。 本文通过沉默生精过程中Zfy基因的表达，影响了Y精子的形成。值得指出的是，试 验组与对照组子鼠数量及体重无显著差异，这可能表明沉默Zfy基因对早期胚胎发育没有 影响。同时，将子一代的雌鼠与雄鼠饲养至性成熟并进行交配，子二代鼠的数量及体重 与未进行任何处理的后代鼠间均无显著差异，说明干扰Zfy基因所产生的精子受精后不影 响后代子的繁殖性能。通过干扰Zfy 的表达成功实现了对小鼠进行受精前的性别控制，同 时也为在其他动物的受精前的性别控制奠定了基础。 关键词：RNAi ；小鼠；精子生成；性别控制 I Zfy 基因干扰对小鼠 Y 精子生成的影响 Abstract Testis is the capital genital gland of masculinity. It secretes androgenic hormone and the place where is spermatogenesis. Zfy locates in short arm of Y chromosome and is related with spermatogenesis. Zfy is activating transcription factor, lead the target gene through the nuclear membrane and orientation in the inner of spermatid nucleus. According to the character of Zfy, the present study designed shRNA fragment, carried out the RNAi experiment about Zfy. Expression level of Zfy mRNA was determined by RT-PCR, and statistics the sex propor