CRISPR-Cas9技术的发展与应用.docx

CRISPR/Cas9技术的发展与应用 Zujia.W 摘要： 成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins, CRISPR/Cas) 技术是近两年出现的一种定点基因组编辑新工具，具有灵活、高效、廉价且易于操作等优点。这种新的基因编辑工具的出现，为基因功能、疾病分子机制的研究带来了便利,并且在研究和使用过程中不断创新发展，扩大了其应用范围。 关键词：成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白 基因编辑 转录调控 基因治疗 ABSTRACT: Clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated proteins (CRISPR/Cas) has been developed as a new targeted genome editing tool since the last 2 years. Because its flexible, efficient, cheap and easy to operate, it quickly surpass the previous technologies to become the hottest genome editing tool. The emergence of this new gene editing tool have brought great convenience for researcher in gene function, molecular mechanisms of disease.In the process of research and use,this technology is going through continuous innovation and development, expanding its scope of application. Key words: CRISPR/Cas genome edting transcription regulation gene therapy 基因编辑技术指采用一定的方法技术对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的的突变，敲除、插入等改变。基因编辑技术主要包括：化学和UV诱导的基因突变；DNA重组酶介导的基因置换；锌指酶（ZFNs）和类转录激活效应因子核酸酶（TALENs）基因编辑系统，以及2013年问世的以gRNA为向导的CRISPR/Cas系统[1]。 CRISPR/Cas系统的组成 CRISPR/Cas系统最初在细菌中被发现，是细菌体内重要的适应性免疫的结构基础，帮助细菌抵抗病毒和噬菌体。细菌体内的CRISPR/Cas系统包括介导DNA识别的CRISPR RNA(crRNA)，和介导DNA切割的Cas核酸酶。 典型的CRISPR基因主要由Cas基因家族和CRISPR序列原件构成。CRISPR序列是高度保守的一段序列，由严格保守的21-48bp的重复序列（repeats）和高度可变的间隔物序列（Spacers）交相间隔组成。 CRISPR基因的典型结构 目前，主要鉴定发现了三种CRISPR/Cas系统，而TypeⅡ是最常见最常用的一种CRISPR/Cas系统，该系统发挥作用只需要一种Cas蛋白——Cas9。 通过晶体结构分析发现[2]，Cas9蛋白主要包含有两个结构域，分别是发挥识别功能的REC结构域，发挥剪切功能的NUC结构域。其中NUC结构域又由RuvC, HNH 和 PAM-interacting (PI)组成，当RuvC和HNH同时发挥切割作用时，就可以形成DNA的双链断裂（DSB）。 CRISPR/Cas9技术的发展 利用CRISPR/Cas9技术，通过设计特异性的sgRNA，可以实现特异性的DNA识别，并且在靶向位置完成切割，再通过细胞本身的DNA修复机制，完成断裂处的修复，从而实现目标基因的“编辑”。 随着CRISPR/Cas9技术的广泛应用和研究的深入，从经典的CRISPR/Cas9技术中也衍生出了各种更为精准有效的应用技术。通过修饰改变Cas9的功能结构域，完成了对CRISPR/Cas9技术的一次次创新。 Cas9切口酶（Cas9 nikase, Cas9n） 将Cas9蛋白的NUC结构域（切割域）中RuvC或HNH任意一个切割结构位点诱导突变，使其失去切割DNA的活性，这样的Cas9蛋白就称为Cas9切口酶（Cas9 ni