免疫组织化学概述与制片-培训课件.pptVIP

透明：二甲苯Ⅰ 15~30分钟 二甲苯Ⅱ 15~30分钟 浸蜡： 软蜡 30~45分钟 硬蜡 30~45分钟 包埋 切片 贴片（温水捞片） 烤片（370C过夜） （七）脱蜡和水合: 脱蜡:二甲苯脱去石蜡切片的蜡，两次 水合（水化、下行入水）： 酒精浓度：逐步降底 100%酒精→95%酒精→80%酒精→蒸馏水 （八）抗原修复 1、原因：甲醛使蛋白质发生凝固，分子间会发生交联 2、目的：抗原再现 3、方法：酶消化、热诱导的抗原修复 （1）热诱导的抗原修复： ①定义：高温、高压对石蜡切片进行抗原修复或复原。 ②修复方式：a微波 b煮沸 c高压锅。  （2）酶消化：　　①去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白 ②断交联 蛋白酶的种类0.05%～0.1％胰蛋白酶：细胞内抗原0.4%胃蛋白酶：细胞外基质内抗原 （九）封闭 原因:蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上 解决办法: 滴加第二抗体来源动物之非免疫血清 抗体稀释液中加入牛血清白蛋白 1、滴加抗体：抗体浓度要合适的 2、温育时间: 370C, 30~60分钟, 湿盒中 ；40C,过夜，呈色 （十）免疫染色 （十一）复染（1）目的：将机体组织细胞染上颜色，衬托出组织形态结构。（2）部位：染细胞核（3）复染剂：苏木素、甲基绿、核固红 （4）染料（复染剂）的特性 ①有颜色 ②与被染组织有亲和力 发色团：产生颜色的原子团 助色团：使染料对组织有亲和力的原子团。 发色团： 硝基、亚硝基、偶氮基、羰基、烯基、醌型苯环 发色团多的染料，颜色深 助色团： — OH、 —COOH、 —NH2、 —N CH3 CH3 有色物：只有颜色，无亲和力 ③染料的分类 根据来源分类 天然：苏木素（植物），胭脂红（动物胭脂虫） 人工合成：苦味酸，偶氮染料 根据化学反应分 酸性染料 碱性染料 ※酸性染料：酸性助色团（ —COOH，—SO3H等），带负电荷。伊红 ※碱性染料：碱性助色团（—NH2、 —NCH3等）， 带正电荷。美兰、苏木素 ※中性染料：酸性、碱性助色团。瑞氏粉、姬姆萨 根据染色对象分 ①胞核染料：苏木素，胭脂红 ②胞浆染料：伊红、苦味酸 ③脂肪染料：苏丹Ⅲ、Ⅳ，油红O （5）染色原理 物理和化学综合作用 物理作用： ①渗透作用：不牢固 ②吸附作用： 分子引力作用，色素粒子被吸附 ③吸收作用：牢固 化学作用 细胞主要成分：蛋白质 含 —NH2 与酸性染料（带负电荷） —COOH 与碱性染料（带正电荷） （碱性） （酸性） 细胞核（酸性物质多）：与碱性染料亲和力强 细胞质（碱性物质多）：与酸性染料亲和力强 （十二）分化与封藏 1、分化（分色） 概念：把过染的部分褪至适当的程度，去掉不应着色的颜色。 对苏木素染色的组织分色:用0.5~1%的盐酸酒精。 分化剂（脱色剂）: 脱去切片上过染的颜色的试剂 以酸褪碱性染料，以碱褪酸性染料（含碱的自来水） 2、封藏（固） （1）目的 防止退色、受潮、干裂及磨损等，使切片永久保存 （2）常用封藏（固）剂 ①干性（常用）：保存时间长，封固前：须脱水、透明 中性树胶（液态或固态） 便宜 加拿大树胶（固态） 较贵 香柏油 凝固太慢 ②水性： 甘油：液态，图象清晰度不佳 甘油明胶：固态，凝固性 不需脱水、透明，保存时间短 （3）封固注意事项： ①树胶不能搅拌 ②树胶量要合适 ③标本表面二甲苯不能挥发干 ④盖玻片大小适宜：标本周围留2mm空白 ⑤封片时都避免产生气泡 （十三）免疫组化结果的观察和记录 1、结果判断: 阳性细胞的染色特征 (1) 阳性细胞染色部位: 胞浆;胞核;胞膜。胞浆：多 (3)阳性细胞分布：局灶性和弥漫性 (2)不同阳性细胞染色强度：不一。非特异染色：所有的细胞染色强度相同 (4)阳性染色细胞与阴性