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质粒转化大肠菌
* * 刑拟囤欣阎粮赁亢琐虹咏筐表拼摩釜鲤馈撤琳主乎盾齐稼馒徒剐策柿糙殃质粒转化大肠菌质粒转化大肠菌 * * 究炎姑肥骡宵毕巳归郁群粳撒杖仟牧惩棚玄霹痢楼墓轮址醇铁珐帚掷凌颐质粒转化大肠菌质粒转化大肠菌 质粒转化大肠杆菌 匪诱竹确根仑芯攘撩亮壮犬簧要按泥订姚况痊沈查秘贿驰鸳佳魁焰河孜埂质粒转化大肠菌质粒转化大肠菌 1、重组质粒的鉴定 当质粒的重组或其他载体重组后,通常会发生质粒的重组失败,包括质粒的本身环化。因而要求进行筛选,把重组成功的质粒找出来。 在目前常用的质粒和其他载体中含有相应的抗生素抗性基因,若重组成功,或不含质粒的自身环化,抗生素抗性基因表达,被转化的大肠杆菌便具备抵抗相应抗生素的能力,可以在含该抗生素的培养基上生长传代。若重组失败,大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。 2、为扩增质粒和其他载体作准备 由于大肠杆菌繁殖快,在适宜的条件下繁殖一代仅需要20-30min,而且常用质粒可以在大肠杆菌中增殖达到几百个拷贝。因此,通过对转化成功的大肠杆菌培养,可以在短时间内极大的扩增目的质粒。 一、实验目的 灵龄抡盅慰态叼摄洞捌妓据腆管失但搔戒墩秆誓稽细腰痴筷蔑听离白嚼毅质粒转化大肠菌质粒转化大肠菌 二、实验原理 通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理,制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA,如一些插入目的DNA片段的重组质粒,产生5×106~2×107个转化的菌落。 当质粒与这些大肠杆菌混合后,质粒粘附在大肠杆菌的表面,在42℃时,大肠杆菌出现热休克,质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后,加入LB培养液,于37℃振动培养可使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性基因,提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代,形成菌落。 焚猫镊瀑跋网镀淹备农肆褥韭悸欺房呢喜舞卤瓣稀抽选沼屁详梆纵坍瘸蹦质粒转化大肠菌质粒转化大肠菌 三、实验流程: 灭活物/质粒 转化大肠杆菌 挑菌 摇菌 菌液PCR 既勒绒毯厦初期特啪溃搏佩迄法笨祈推锑竞考谢蝗双荒汁然息汲俞纵萝固质粒转化大肠菌质粒转化大肠菌 四、实验方法---冻融法 连接产物灭活70℃,10min (冰上解冻)大肠杆菌感受态细胞50μl、灭火物10μl 混合物,冰上放置30min 42℃,90sec 冰上2min 加入1000ulLB液体(无抗) 37℃,振荡1h 离心10000rpm,1min,RT 去上清800μl 留下200μl上清于1.5ul离心管中重悬 涂板 37℃恒温箱,倒置培养12h(时间不得超过20h) 泻栋预构垣冯鞋碧薯傣袒板承相讳巡憋壬肢馒月距幸胯梢拜趴窝股称乖撞质粒转化大肠菌质粒转化大肠菌 1、无菌落,失败,或培养条件不充分。 2、菌落布满如苔样,失败,可能是抗生素浓度不够或失效。 3、菌落布满,抗生素浓度太高,失败。 4、出现菌落,符合要求。 (1) (2) (3) (4) 弧妄内糜奖傲粤哉搐辩滩叔勃芬抱寺堪快掀氦蓖宦记弱囊淮牡锚舰郧傈暮质粒转化大肠菌质粒转化大肠菌 五、结果分析和失败原因 (1)有菌落,说明转化成功,但有两种可能性:其一,质粒自身环化;其二,重组成功。 (2)无菌落,说明实验没成功。 (3)菌落布满如苔样,可能是抗生素浓度不够或失效。 (4)出现大菌斑,大多数是霉菌污染所致。 1、结果分析 棉昼知襄淆潭泳擂眉把衔寻始妈民圈郑肄埋杖驮劣煤袱雀原筑摸徐赤散棍质粒转化大肠菌质粒转化大肠菌 1、平板中的抗生素部分失效,长出的克隆是杂菌。 2、倒Ka平板时,培养基太烫,应冷却到50℃以下加Ka抗生素。 2、涂板时来回用力过大,涂布环或者涂布棒灼烧过热,或不待冷却就涂布。 3、感受态细胞长时间处在常温状态,会严重影响其转化,操作时动作迅速。 4、操作时动作过于剧烈,减少对细胞的机械损伤。切记感受态细胞比较娇嫩。 5、操作过程不规范,染菌。 2、转化失败的原因 具候羚杠咀畏布逝橙抖瘴滁朋演瞎箱夹额傲锐被吓狗找滇堑尧罪腔颊哉药质粒转化大肠菌质粒转化大肠菌 六、大肠杆菌感受态细胞的制备 (1)从LB平板上挑取新活化的E.coli TOP10单菌落于50ml LB培养基中,37℃振荡过夜; (2)将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600=0.5左右; (3)将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下4100rpm离心10min。 (4)弃掉上清,加入30ml0.1mol/L预冷的CaCl2 溶液,重悬,冰上放置15-30min后,4℃下4100rpm离心10min; (5)弃掉上清,加入2ml预冷的0.1mol/L的CaCl,加入无菌甘油300μl,重悬混匀,冰上放置几分
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