SIS载体固定化纤维素酶性质的研究.pdfVIP

S-IS载体固定化纤维素酶性质的研究 柴梅’，袁振宏2，颜涌捷*s143 (1华东理工大学资源与环境工程学院，上海200237; 2中科院广州能源所，广州 510640) 摘要:选用国内固定酶方面研究较少的肠溶衣聚合物EudragitL100为载体，采用物理吸附法，制 备出具有可溶一不可溶性质的固定化纤维素酶。固定化酶的溶解度变化的条件是:pH--5.0时，呈可 溶性:pH-4.0时，呈不可溶性。固定化酶的稳定性较好，重复利用四次后，酶活力保留值在65 以上.比较了固定化酶和游离酶的最适反应条件和动力学常数的大小.以2%的滤纸为底物(15FPU/g 底物)，固定化酶水解反应的效果比游离酶好。该研究结果在提高纤维素原料酶水解工艺的经济性方 面具有重要意义。 关键词:Eudragit，固定化，纤维素酶 0前 言 生物质是唯一能转化为液体燃料的可再生能源。由生物质生产乙醇燃料，可以直接代替汽油、 作为民用燃烧或内燃机燃料.利用纤维素酶水解纤维素原料是乙醇生产工艺中的一个重要技术，但 由于纤维素酶的生产成本比较高，阻碍了该技术的应用。为此，从有效增大纤维素酶利用率和增强 酶稳定性的角度出发，本文选择了一种S-IS载体来固定纤维酶。S-IS载体具有随着溶液某个特定 ‘条件如pH值、温度范围不同，或加入了某种金属离子，其溶解性质会改变的特性。将纤维素酶固定 在这种载体上，克服了不溶性和可溶性载体固定化酶的缺点，在水解反应时采用可溶形式，反应结 束后，调节为不可溶形式，方便回收固定化酶。 肠溶衣聚合物是一类固定化酶效果很好的S-IS载体[(1.2.31.其中Eudragit是一种包括甲基丙烯 酸共聚物和甲基丙烯酸酷共聚物的肠溶衣聚合物，国内通称为丙烯酸树脂。Taniguchietal等人 曾将其用于固定淀粉酶，蛋白酶等种类的酶(4.5.61.各种Eudragit聚合物的水溶性条件不同，我们 根据纤维素酶水解的反应条件，·选择EudragitL100作为固定化酶的载体。EudragitL100是甲 基丙烯酸和甲基丙烯酸甲醋 (1:1)的共聚物，由于其结构中含有梭基，在水中很容易与碱生成盐 而溶解，于是改变溶液的pH值就能调节聚合物的溶解状态. 目前，国内S-IS载体固定化酶的相关报道很少，国外近几年利用S-IS载体固定纤维素酶的 研究也比较少.本文采用物理吸附法将纤维素酶固定在EudragitL100上，，并对固定化酶的溶解度 性质及稳定性、最适pH值、最适反应温度、表观米氏常数、离子强度对酶活力的影响等理化性质进 行了探讨。 1材料和方法 1.1材料 EudragitL100，德固赛化学 (上海)有限公司提供;纤维素酶，诺维信 (中国)投资有限公 司提供;底物，滤纸，杭州新华纸业有限公司产品;其它试剂均为分析纯试剂。 1.2方法 1.2.1载体溶液的配制 将2.5gEudragitL-100加入到持续搅拌的40ml蒸馏水中，滴加3MNaOH直到pH=11.0,聚合 物完全溶解后，加入3M乙酸溶液，使溶液的pH=9.0，用蒸馏水将溶液定容为50ml，将溶液4℃保存。 1.2.2纤维素酶的固定化 将一定量的酶液加入到5m1EudragitL100溶液中，混合均匀，恒温放置一段时间后，边搅 .2荃金项目:国家863重大课题。纤维素废弃物制取乙醉技未”(No.2003AA514020)通讯联系人:E-mail: 拌边滴加1M乙酸，至 (pH=4.0左右)树脂基本沉淀下来，溶液呈现一种不溶解状态，静置20min, 离心(4000Xg10min)，取出上清液，沉淀用0.01M,pH=4.0醋酸盐缓冲液冲洗，最后溶解在pH=5.8, 0.1M醋酸盐缓冲液中，定容至8ml.由此得到的就是固定化酶溶液。 1.2.3纤维素酶活力的测定 游离态纤维素美的活力按照文献[[7I，在四个比色管中加入不同稀释度的酶溶液。.5ml，和lml乙 酸一乙酸钠缓冲液和一条1.0X6.0cm(约50mg)的滤纸，50℃恒温1h，分别加入3mlDNS，在沸水 浴中显色5分钟，冷却至室温，于540nm测上清液吸光度值。 固定化酶活力的测定:在固定化酶呈溶解性的状态下测定酶液的酶活，测定和计算方法同游离 酶。 酶活力计算采用比活力，以酶解生成2.Omg葡萄糖时的酶浓度来计算纤维素酶的比活力。纤维 素酶的FPA比活力(FPU)由