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海藻学实验指导 温州医学院生命科学学院海洋系 2009年5月 实验一 藻类细胞的观察和计数 一、实验目的1．了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能；2．二、实验原理? ? 测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。? ? 显微计数法适用于各种含单细胞的纯培养悬浮液。血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中的数量，再换算成每毫升细胞的数量。1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格， K=4×106 。每ml菌液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）高倍镜观察并计数。 3、如用16X25计数板，只计四个角上中方格的菌数。若是25X16的计数板，除计数四个角上的中格菌数外，还要计算中央中格的菌数。每个样品重复计数2~3次。计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌体。4、位于格线上的藻细胞一般只计此格的上方线及左方线上的菌体。5、计数方法：样品中菌数/ml=每小格平均菌数x4000,000x稀释倍数，本实验采用25x16规格，要求数这些方格中的全部小格即80个小格。设：每个中方格的菌数为A，则每小格平均菌数=（A1+A2+A3+A4+A5)/80样品中的菌数/ml=（A1+A2+A3+A4+A5）/80X4000,000X稀释倍数 结果记录微生物名称????????????? ? ?总细胞数????????????????????????? ?个/ml ? 第一个中格 第二个中格 第三个中格 第四个中格 第五个中格 第一次测定 ? ? ? ? ? 第二次测定 ? ? ? ? ? 平均 ? ? ? ? ? 四、测定注意事项:1、测定时，藻液要要摇匀，防止细胞沉淀。2、位于格线上的酵母菌一般只计此格的上方线及左方线上的藻细胞。 五、思考题 1，采用血球计数板的计数是，如何减少误差？ 附：鲁格氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300mL。先将碘化钾溶于3~5ml蒸馏水中，然后加碘，摇匀，使碘完全溶解后，再加蒸馏水至足量。装入棕色试剂瓶。 实验二 藻细胞大小的测定 一、实验目的 ??? 了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法。 　　 　　1mm等分为100格（或2mm等分为200格），每格长度等于0．01mm（即106μm）。是专用于校正目镜测微尺每格长度的。 　　50小格或100小格两种，每5小格间有一长线相隔。由于所用接目镜放大倍数和接物镜放大倍数的不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也就不同，因此，目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小，在使用前必须用镜台测微尺进行校正，以求得在一定放大倍数的接目镜和接物镜下该目镜测微尺每小格的相对值，然后才可用来测量微生物的大小。 三??材料 3.1??器械 显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺，载玻片、盖玻片、血球计算板、擦镜纸、吸水纸、玻片架、洗瓶、滴管。 3.2??种 培养。 流程 4.1?置目测微计→置台测微计→标定目测微计→测大小→记录结果→用毕擦拭干净 4.2?检查计数板→稀释样品→加样→计数→计算→清洗 ??步骤 1??目镜测微尺的校正更换目镜测微尺镜头（标记为PF）；或者取下目镜上部或下部的透镜，在光圈的位置上安上目镜测微尺，刻度朝下，再装上透镜，制成一个目镜测微尺的镜头。 2??某一倍率下标定目镜刻度将镜台测微尺置于载物台上，使刻度面朝上，先用低倍镜对准焦距、看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器使两尺重叠，并使二尺的左边的某一刻度相重合，向右寻找另外二尺相重合的刻度。记录两重叠刻度间的目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。 3??计算该倍率下目镜刻度?目镜测微尺每格长度=镜台测微尺格数/目镜测微尺格数xl0um 4??标定并计算其他放大倍率下的目镜刻度以同样方法分别在不同倍率的物镜下测定目