内毒素对鼠肺-肠微血管及体外培养内皮细胞通透性的影响及凋亡在其中的作用论文.docVIP

　　内毒素对鼠肺/肠微血管及体外培养内皮细胞通透性的影响及凋亡在其中的作用论文 .freelg/kg和10mg/kg LPS均可造成肺、回肠组织伊文氏兰含量增加（P 0.01 或0.05）。(2)100μg/ml LPS可显著增加体外单层HUVEC对牛血清白蛋白的通透性（P 0.05或0.01）。(3)LPS可引起的体外培养内皮细胞的凋亡。结论 (1)LPS能迅速提高体内肺微血管内皮细胞通透性，而LPS作用后6h肠微血管通透性开始增加。(2)LPS可剂量依赖性的引起体外培养脐静脉内皮细胞通透性升高。(3)细胞凋亡可能是引起内毒素血症时内皮细胞通透性的原因之一。 【关键词】 内皮细胞通透性；内毒素 【Abstract】 Objective To observe the alteration of pulmonary and ileum microvascular permeability of rats and permeability alteration of monolayer endothelium in vitro folloinistration of lipopolysaccharide.freeleability.Methods (1)To investigate the alteration of microvascular permeability of pulmonary and ileum in endotoxemia. (2)The effect of LPS on the permeability of human umbilicus vein endothelial cells (HUVECs) monolayer in vitro. (3)To observe the apoptosis of HUVECs folloinistration of LPS. Results (1)The Evan’s blue content of pulmonary and ileum ia， but only the pulmonary reached significance(P 0.05 or 0.01). (2)199培养液，肝素，胶原酶(TypeⅠ，199培养液约30ml冲洗，收集，500g×5min离心。加入M199工作液重悬细胞，计数，将细胞接种于2%明胶包被的75cm2塑料培养瓶，37℃、5%CO2空气常规培养。采用0.05%胰酶-0.02%EDTA常规消化传代，细胞的鉴定采用Ⅷ因子抗原检测法、DAB染色阳性确定。 1.2.3 体外内皮细胞通透性实验 实验分组（N=54，n=9）：正常对照组，LPS组（终浓度1，10，100μg/ml）。采用3～5代细胞，实验时24孔细胞培养板中加入M199工作液600μl，用预先包被胶原的Transg/ml)10μl，于15、30、45、60、90、120及180min后取下腔液体10μl，在荧光检测仪上测定(激发波长488 nm，发射波长525 nm)其荧光含量。各时间点的FITC-BSA透过量以下腔累计的示踪剂百分率(%)表示。各实验组以时间-示踪剂透过百分率作图，其斜率为示踪剂FITC-BSA透过单层内皮细胞进入下腔的速率(示踪剂透过量/min)。各组透过速率以x±s表示，采用t检验进行统计学分析。 1.2.4 LPS对内皮细胞凋亡/坏死的影响 实验分组及处理同前，待生长至80%融合时加入处理因素作用4h。用1×PBS轻轻洗涤细胞后加入AO-EB染色，作用30s后吸弃，用1×PBS洗涤。激光共聚焦显微镜（Leica LCS SP2，德国）下观察。 2 结果 2.1 内毒素血症对大鼠肺、肠组织伊文氏兰含量的影响（μg/g干组织） 见图1、2。 2.2 LPS和组织胺对体单层HUVECs通透性的影响 见图3。 2.3 LPS对内皮细胞凋亡/坏死的影响 细胞经AO-EB染色，在激光共聚焦显微镜下观察，健康活细胞的胞核呈绿色网状结构，胞浆有红-橙色颗粒；凋亡细胞可见细胞收缩变圆，整个细胞呈均匀的绿色；坏死细胞则呈明亮的红色。结果显示，对照组细胞生长正常，无凋亡和坏死细胞出现（图4），而100μg/L LPS处理后凋亡细胞增多，并可出现坏死细胞（图5）。 图4 对照组细胞经AO-EB染色，可见细胞后，可见生长正常，无凋亡或坏死细胞。40× 图5 100μg/ml LPS处理内皮细胞部分凋亡晚期或坏死细胞。40× 3 讨论 LPS是革兰阴性细菌合成释放的主要毒素，是导致感染性休克的最重要的生物因子。内皮细胞是其主要的作用靶细胞之一，而肺、肠是最易受到攻击的靶器官［2，3］。受到攻击的肺微血管通透性增加是其重要特征，其机