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微生物菌种保藏 一、实验目的及要求 1.了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。 2.学习斜面传代保藏方法、液体石蜡保藏方法、冷冻干燥保藏方法。 二、实验器材 1.大肠杆菌、酵母菌、放线菌和青霉菌斜面。 2.无菌水、液体石蜡、脱脂奶粉、10%HCl、干冰、95%乙醇、Nacl、移液器、接种环、安瓿管、冰箱、冷冻真空干燥装置、酒精喷灯、三角烧瓶(250mL)。 三、操作步骤 (一)斜面传代保藏法 l．斜面接种 将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上，细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞，而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的孢子。 2．贴标签 取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2－3cm处。 3．培养 细菌37℃恒温培养18－24h，酵母菌于28－30℃培养36－60h，放线菌和丝状真菌置于28℃培养4－7d。 4．保藏 斜面长好后，可直接放入4℃冰箱保藏。为防止棉塞受潮长杂菌，管口棉花应用牛皮纸包扎，或换上无菌胶塞。 酵母菌、霉菌、放线菌及有芽抱的细菌可保存2－6个月，移种一次；而不产芽孢的细菌最好每月移种一次。 (二)液体石蜡保藏法 l．液体石蜡灭菌 在三角瓶中装入适量液体石蜡，塞上棉塞，牛皮纸包扎，12l℃湿热灭菌30min，然后置105－110℃烘箱中lh，以除去石蜡中的水分，备用。 2．接种培养 同斜面传代保藏法。 3．加液体石蜡 用无菌滴管吸取液体石蜡以无菌操作加到已长好的菌种斜面上，加入量以高出斜面顶端约1cm为宜。 4．保藏 棉塞外包牛皮纸，将试管直立放置于4℃冰箱中保存。霉菌、放线菌、有芽孢细菌可保藏2年左右，酵母菌可保藏1－2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。 (三)冷冻干燥保藏法 1．准备安瓿管 选用内径5mm，长10.5cm的硬质玻璃试管，用10%HCl浸泡8－10h后用自来水冲洗多次，最后用去离子水洗1－2次，烘干，将印有菌名和接种日期的标签放人安瓿管内，有字的一面朝向管壁。管口加棉塞，121℃灭菌30min。 2．制备脱脂牛奶 将脱脂奶粉配成20%乳液，然后分装，121℃灭菌30min，并作无菌试验。 3．准备菌种 选用无污染的纯菌种，培养时间：一般细菌为24－48h，酵母菌为3d，放线菌与丝状真菌7－10d。 4．制备菌液及分装 吸取3mL无菌牛奶直接加入斜面菌种管中，用接种环轻轻搅动，再用手摇动试管，制成均匀的细胞或孢子悬液。用无菌长滴管将菌液分装于安瓿管底部，每管装0.2mL。 5. 预冻 将安瓶管浸入装有干冰和95%乙醇的预冷槽中，(此时槽内温度可达-40－-50℃)，冷冻1h左右，即可使悬液冻结成固体。 6. 真空干燥 保持安瓿管内的悬液仍呈固体状态。开启真空泵后，使被冻结的悬液开始升华，冻结样品逐渐被干燥成白色片状，此时使安瓿管脱离冰浴，在室温下(25~30℃)继续干燥。 7．封口样品 干燥后继续抽真空达1.33Pa，在安瓿管棉塞的稍下部位用酒精喷灯火焰灼烧，拉成细颈并熔封，然后置4℃冰箱内保藏。 四、注意事项 1．从液体石蜡封藏的菌种管中挑菌后，接种环在火焰上灭菌时要先在火焰边烤干再直接灼烧，以免菌液四溅，引起污染。 2．真空干燥过程中安瓿管内样品应保持冻结状态，以防止抽真空时样品产生泡沫而外溢。 3．熔封安瓿管时注意火焰大小要适中，封口处灼烧要均匀，若火焰过大，封品处易弯斜，冷却后易出现裂缝而造成漏气。 五、实验报告 1．结果 * * 培养 温度 培养基 拉丁名 学名 操作 要点 保藏 温度 保藏 方法 培养条件 菌种名称 接种 日期 2．试述各种菌种保藏方法的优、缺点。