家族性与散发性帕金森病Parkin基因4号外显子突变的差异性研究论文.docVIP

　　家族性与散发性帕金森病Parkin基因4号外显子突变的差异性研究论文 李立宏 高国栋 王学廉 赵振伟 贾栋 【关键词】 帕金森病 Difference study on sporadic Parkinsons disease and familial Parkinsons disease in exon 4 of Parkin gene 【Abstract】 AIM: To study the difference of exon 4 mutation of Parkin gene betilial Parkinsons disease (FPD) by PCR, gene sequence detection and TDI-FP technique, to explore the important role of Parkin gene in the pathogenesis of Parkinsons disease, and to establish a neethod for genotyping of mutation patterns. METHODS: The experiment group included 36 FPD patients and 114 SPD patients, and the control group consists of 150 healthy subjects. The target DNA fragment of Parkin gene exon 4 plified by polymerase chain reaction and the lost fragments utation type and a ine the SNP mutation genotype. RESULTS: Of the 36 cases ent lost utation ent lost utation ent lost utation utation may be one of the key factors in the pathogenesis of Parkinsons disease. Sporadic Parkinsons disease and familial Parkinsons disease have different mutation patterns, ay be related utation;exons 【摘要】 目的： 通过聚合酶链式反应（PCR）、基因测序技术及TDIFP技术，检测散发性与家族性帕金森病Parkin基因4号外显子突变的差异性，探讨Parkin基因突变在PD发病机制中的作用，同时建立一种新的突变检测方法.方法: 以36例家族性及114例散发性PD患者为实验对象，150名正常健康人为阴性对照，通过PCR扩增含Parkin基因4号外显子的DNA片段，电泳分析初次筛选片段缺失者.基因测序技术对无缺失片段进行克隆、测序，筛选出突变型及野生型.最后应用TDIFP技术检测R110或TAMRA标记ddNTP的FP值.freelL，加05 mL的20 mL/L EDTA抗凝，应用ReadyPCRTM(华美公司生产)全血基因组DNA纯化系统提取全血基因组DNA. 122目标DNA片段的提取应用PCR扩增技术对Parkin基因4号外显子进行扩增.从Medline查Genbank，参照Parkin基因的序列，应用DNA Star软件设计exon 4引物（上海博雅生物技术有限公司合成）.上游引物序列为： 5′TGCAGCATTATTAGCCACTTCTT3′，下游引物序列为： 5′TTCGGCTATCATTAACTATCACAA3′.反应体系为： MgCl2、dNTPS（10 mmol/L）、10×buffer 各25 μL，P1和P2各1 μL，Taq聚合酶1单位.加水补足25 μL.反应条件为94℃变性10 min；55℃退火30 s，72℃延伸30 min； 进行40个循环， 72℃延伸10 min.取5 μL PCR扩增产物在15 mL/L琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色、显带，观察条带缺失情况. 123基因测序分析分别对家族性、散发性及阴性对照组中未出现exon 4缺失突变的PCR扩增序列5例进行分子克隆，方法： 对DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定、回收，与T载体连接，体系如下： T载体1 μL，目的片段4 μL，solutionⅠ5 μL16 ℃1～4 h.转化大肠杆菌DH5a 涂Amp＋ 板子.挑单克隆，37 ℃摇匀过夜提质粒.酶切鉴定.送上海博雅生物技术有限公司对其DNA进行测序，筛选出阳性对照（突变型）及阴性对照（野生型）. 124突变位点的SN