家族性肌萎缩硬化症酵母研究模型的探索论文.docVIP

　　家族性肌萎缩硬化症酵母研究模型的探索论文 张小华 王跃嗣 牛新华 【摘要】 目的 构建铜锌超氧化物歧化酶（SOD1）基因缺失的酿酒酵母菌株, 为进一步以酵母为模型开展家族性肌萎缩硬化症发病机制及防治研究奠定基础。方法 运用LFHPCR构建了带有遗传霉素抗性基因（KanMX4）的SOD1基因中断框，转化酿酒酵母BY5677，以添加G418的平板筛选出SOD1基因缺失菌株，并经PCR鉴定。结果 PCR扩增证实SOD1基因已被成功敲除；与野生菌株相比，SOD1基因缺失菌株生长缓慢。结论 成功构建了SOD1基因缺失的酿酒酵母菌株。 【关键词】 家族性肌萎缩硬化症；酿酒酵母；SOD1；LFHPCR 【Abstract】 Objective To construct the SOD1 gene deletion mutant of Saccharomyces cerevisiae and lay a foundation for studying the pathogenesis and treatment of familial amyotrophic lateral sclerosis based on the yeast model.Methods The SOD1:KanMX4 gene deletion fragment ology LFHPCR and transferred to yeast strain BY5677. The SOD1 gene deletion mutant ed by PCR.Results The PCR analysis shoutant greutant ilial amyotrophic lateral sclerosis，Saccharomyces cerevisiae，SOD1.freelilial amyotrophic lateral sclerosis, FALS）是一种进行性致死性神经系统变性疾病，5%～10% 的患者有家族性，其主要临床表现是肌肉逐渐萎缩无力，患者最后会因呼吸衰竭而死亡［1，2］。目前研究认为FALS的发病与铜锌超氧化物歧化酶(Cu／Zn superoxide dismutase，SOD1)基因突变有关，但是其具体机制尚不清楚［3］。SOD1基因从酵母到人具有高度的保守性［4］，作为一种模式生物，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)已经广泛的被运用于人类遗传疾病研究［5，6］。本文利用LFHPCR技术,构建SOD1基因缺失的酵母菌株，对家族性肌萎缩硬化症酵母研究模型的建立进行了探索。 1 材料与方法 1.1 菌种和质粒 酿酒酵母BY5677 (MATa leu2～3/112 ura3～1 trp161 his3～11/15 ade2～1 can1～100 GAL SUC2 mal0) 由日本酵母遗传中心提供。酵母质粒pLEJ009由美国明尼苏达州大学David T. Kirkpatrick教授惠赠。 1.2 主要试剂和仪器 pfu DNA聚合酶、胶回收试剂盒、G418购自北京全式金公司。 酵母粉、蛋白胨、鱼精DNA购自上海生工公司，其它化学试剂均为国产分析纯。引物委托上海博亚公司合成。 1.3 培养基 酵母用YEPD培养基：葡萄糖 20 g，蛋白胨10 g，酵母粉10 g，加蒸馏水至1 000 ml，pH 6.0～6.5, 8磅30 min灭菌。固体培养基添加2%(的乙酸铵、1 ml无水乙醇混匀后13 000 r/min离心10 min，去上清干燥，用100 μl的TE溶出。 1.5 酵母完整细胞转化法 将过夜培养的菌转接至50 ml YEPD中，使菌体浓度OD600为0.25，30℃振荡培养到一定菌体浓度（OD600），离心收集菌体，用无菌水洗涤，1 ml的100 mmol/L LiAc洗涤，重悬细胞于400 μl的100 mmol/L LiAc中混匀。分成50 μl小份离心后，依次加入240 μl 50% PEG6000，36 μl 1 mol/L LiAc，5 μl 单链鱼精DNA，70 μl 无菌重蒸水和质粒DNA混匀。30℃保温30 min后，42℃水浴中热激25 min。离心除去上清，重悬细胞于无菌水中，涂布相应的选择平板，30 ℃恒温培养3～4 d。 1.6 SOD1基因中断框的构建 SOD1基因中断框的构建采用Ulrich等报道的LFHPCR法，依据遗传霉素抗性基因(KanMX4)和SOD1基因上下游序列设计4条引物（序列分别为:SOD11:AGTATCTCTGAAGTGCAG;SOD12:TTACGATCCATTGACTGCAGCGTACTATAAATTAATTATG