怎样用碳二亚胺法将半抗原偶联到蛋白上.docVIP

如何用碳二亚胺法将半抗原偶联到【摘要】 ?用碳二亚胺（EDC）法将14位羟基修饰的雷公藤内酯醇(TP)和不同的蛋白载体（阳离子化牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白）偶联合成TP的人工免疫抗原和检测抗原，紫外光谱鉴定偶联效果，计算偶联率。利用免疫抗原免疫小鼠，制备小鼠多克隆抗体，用检测抗原分析血清抗体效价，利用抗原竞争ELISA分析抗体特异性，为进一步研究TP的分子作用机理以及制备TP的单克隆抗体奠定基础。 【关键词】 ?雷公藤内酯醇； 14位羟基修饰； 人工抗原； 多克隆抗体? ?雷公藤内酯醇（triptolide，TP）分子式C20H24O6，分子结构如图1，相对分子质量360.41，为二萜类三环氧内酯化合物，是从植物雷公藤（Tripterygium Wilfordii Hook.f.）中提取的有效成分里活性最强的部分，具有消炎散结、清热解毒、抗菌、免疫抑制以及抗生育等功效。长期以来，TP作为临床上公认的免疫抑制剂，主要用于各种自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎以及器官移植排斥反应的治疗。近年来研究发现，该药对多种肿瘤细胞有诱导凋亡的作用，与化疗药物联合应用能协同杀伤肿瘤细胞或逆转肿瘤耐药，说明它具有抗肿瘤效果，因此在肿瘤治疗方面的应用也日益受到人们的关注。除此以外，它还对细胞发育增殖、细胞周期等有调控作用。近年来，国内外对TP具有如此广泛作用的分子机理产生了越来越浓厚的兴趣，从多个不同的角度进行了研究。但是，由于缺少方便快捷的TP检测手段，长期以来对TP直接作用位点的研究一直十分困难，对TP作用的靶蛋白和作用途径知之甚少。细胞免疫化学是追踪分子在细胞内作用过程的有力工具，如果能够得到TP的抗体，就为利用细胞免疫化学研究TP的作用靶点和在细胞内的定位等提供了分子探针，为最终研究TP作用机制和寻找其靶蛋白提供了可能。作为小分子半抗原，TP需要和大分子蛋白载体偶联才能成为能够诱导产生抗体的免疫原。为了不影响小分子的生物活性，提高偶联效率，我们需要选择合适的反应基团。已有的TP结构活性研究显示，TP的不同生物效应依赖于不同的功能基团。研究证实，对于12，13位环氧进行开环反应所获得的稳定的衍生物雷公藤内酯三醇（triptriolide）会丧失免疫抑制和抗炎的生物活性。14位羟基是TP最容易被改造修饰的基团，研究表明，14位羟基被改造为水溶性的基团作为前药能极大改善小分子的水溶性，促进体内代谢，降低毒性，甚至能改善TP在体内的免疫抑制活性和抗肿瘤活性［12］。? ?综合考虑，TP的14位羟基是最合适的偶联基团。TP的水溶性不理想，且14位羟基不容易在温和条件下和蛋白载体反应，我们首先对14位羟基进行结构修饰，改造为水溶性的羧基，利用缩合反应偶联阳离子化牛血清白蛋白（cationized BSA，cBSA）和鸡卵清蛋白（OVA），合成TP的免疫抗原TPcBSA和检测抗原TPOVA。用免疫抗原免疫小鼠，顺利得到了TP的多抗。? ?1 ?实验部分? ?1.1 ?试剂和仪器? ?TP（购自SIGMA公司），cBSA（购自PIERCE公司），OVA，1乙基（3二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl），福氏完全佐剂（FCA）和福氏不完全佐剂(FIA)，6～8周龄BALB/c小鼠（购自扬州大学比较医学中心）,Sephadex凝胶柱（购自PIERCE）。TP、OVA、1乙基（3二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）、福氏完全佐剂（FCA）和福氏不完全佐剂（FIA）均购自Sigma公司，cBSA、Sephadex凝胶柱均购自PIERCE公司，6～8周龄BALB/c小鼠购自扬州大学比较医学中心。? ?岛津UV2550紫外可见分光光度计，Eppendorf Centrifuge 5415R离心机，TECAN SAFIRE自动酶标仪。? ?1.2 ?TP 14位羟基的修饰以及修饰产物的质谱鉴定? ?将TP的14位羟基进行衍生化修饰，在弱碱性条件下和丁二酸酐进行酰化反应，反应式如图2所示，得到水溶性分子triptolide 14succinate（mTP），用质谱鉴定反应产物。? ?1.3 ?TP人工抗原的制备? ?碳二亚胺（EDC）法偶联mTP与蛋白载体（以cBSA为例，OVA合成的方法类似）：? ?取5 mg mTP和2.5 mg cBSA溶解在250 μl TE buffer（pH 8.0）中，充分震荡使其溶解，再取EDC·HCl 79 mg充分溶解于250 μl TE buffer（pH 8.0）中。将mTP和cBSA的混合溶液边震荡边逐滴加入EDC溶液，在37 摇床中反应2 h以上。先用Sephadex柱分离偶联产物和未结合的mTP小分子，再透析纯化，将0.5 ml 溶液