Ⅱ型登革病毒D01090株在人胚肺二倍体细胞.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（１１）：１７ 檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 檪 研究报告 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 Ⅱ型登革病毒Ｄ０１０９０株在人胚肺二倍体细胞 ＫＭＢ１７上适应株选育及初步鉴定 赵玉娇　潘　癑　阎玲梅　岳耀斐　杨丽娟　孙强明 （北京协和医学院／中国医学科学院医学生物学研究所　云南省重大传染病疫苗研发重点实验室　昆明　６５０１１８） 摘要　目的：选育能在人胚肺二倍体细胞ＫＭＢ１７上稳定增殖的 型登革病毒适应株，为研发以人 Ⅱ 源性细胞为基质的登革疫苗候选株奠定基础。方法：将 型登革病毒中国株Ｄ０１０９０提取病毒基 Ⅱ 因组，通过ＲＴＰＣＲ法进行登革病毒型别鉴定后，在Ｃ６／３６和Ｖｅｒｏ细胞上进行毒种扩增和滴度测 定；将Ｄ０１０９０毒株以４．０ＭＯＩ接种ＫＭＢ１７细胞并反复传代至病毒完全适应在细胞内扩增，并连 续传代１０代，选育出良好的ＫＭＢ１７细胞适应株；病毒培养液经蔗糖梯度离心和超速离心后获得 高浓度病毒液，接种ＫＭＢ１７细胞后通过透射电镜超薄切片检测细胞的病理变化；然后经过三轮蚀 斑纯化筛选出纯化病毒株，免疫荧光法检测病毒纯化株的抗原性。结果：以 型登革病毒中国株 Ⅱ Ｄ０１０９０基因组为模板，能扩增出５１１ｂｐ的登革病毒特异基因和 １１９ｂｐ的 型登革病毒型特异性 Ⅱ 基因。病毒经Ｃ６／３６细胞扩增后滴度达４．５ＣＣＩＤ／ｍｌ，感染ＫＭＢ１７细胞至第三代可产生明显的 ５０ 细胞病变（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ，ＣＰＥ），连续传１０代细胞病变速度逐渐增快，至第１０代达到增殖高峰， 病毒滴度达５．０ＣＣＩＤ／ｍｌ；将病毒感染６天后病变达＋＋＋的ＫＭＢ１７细胞进行超薄切片后经透 ５０ 射电镜观察细胞的病理变化，镜下可观察到内质网中新组装成的病毒颗粒，细胞周围产生很多分 裂的小碎片，伴有游离出胞的病毒；三轮蚀斑纯化后筛选出纯化克隆，免疫荧光法检测病毒的抗 原性呈阳性。结论 选育出了能稳定传代且病毒扩增量高的 型登革病毒ＫＭＢ１７细胞适应株，经 Ⅱ 蚀斑纯化后仍保持较好的抗原性。 关键词　登革病毒　人胚肺二倍体细胞　蚀斑纯化　生物学特性 中图分类号　Ｑ８１３．１ ［３］ 　　登革病毒（Ｄｅｎｇｕｅｖｉｒｕｓ，ＤＥＮＶ）在分类学上属黄 登革疫苗研发迫在眉睫 。目前以人源性细胞制备的 病毒科黄病毒属，依抗原性不同可分为 、 、 、 四 登革疫苗候选株还未见报道，因此研究登革病毒在人 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 个型，当感染某一型ＤＥＮＶ后产生的抗体能与所有四 源性细胞上的适应性对于登革病毒疫苗的研发具有重 ［１２］ 要意义。人胚肺二倍体细胞株 ＫＭＢ１７由医学生物学 型的ＤＥＮＶ起交叉反应 。近年来，全球登革热感染 人群的数量持续增长，已成为世界性的公共卫生问题。 研究所建立并拥有自主知识产权，作为人源性细胞基 迄今为止全球仍没有获准上市的登革病毒疫苗，因此 质生产人用疫苗时，引入的外源因子较少，比动物来源 的细胞基质具有更好的安全性，且能稳定实现大规模 收稿日期：２０１２０７１２　　修回日期：２０