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罗格列酮联合雷帕霉素抑制多囊肾囊肿衬里上皮细胞的增殖及机制研究 【摘要】： 常染色体显性多囊肾病(ADPKD)是人类最常见的单基因遗传性肾病,发病率在1/400-1／1000,我国约有150万患者,占终末期肾衰竭病因5%-10%。ADPKD主要特征表现为双侧肾脏出现许多个进行性增大的液性囊泡,最终破坏肾脏的结构和功能。50%患者在60岁时会进展至终末期肾衰竭。ADPKD除累及肾脏外,还引起肝、胰囊肿、心瓣膜病、结肠憩室和颅内动脉瘤等肾外病变,是一种严重危害人类健康的系统性疾病。 多年来,肾脏病学者一直致力于寻找治疗多囊肾病的有效方法,基因治疗目前存在许多障碍有待克服,通过药物治疗延缓肾衰竭进展是目前的主要研究方向。多囊肾病治疗需要早期、长期用药,因此药物的安全性成为研究者关注的焦点。由于ADPKD的分子发病及调控机制非常复杂,很多问题尚未阐明,因此针对不同发病环节研发不同药物,联合用于治疗不仅可增强疗效,而且减少不良反应,将具有潜在的的应用前景。 噻唑烷二酮类PPARy激动剂,如吡格列酮和罗格列酮等,主要用于糖尿病治疗。近年来研究发现,噻唑烷二酮类PPARy激动剂可抑制多种肿瘤细胞的增殖。2001年Muto等首先观察到吡格列酮可延长多囊蛋白1基因敲除小鼠(pkdl-/-)的生存期(通常在胎儿期死亡)；我科先前动物实验发现,罗格列酮可抑制Han:SPRD大鼠囊肿的进展,延长大鼠生存期,但其机制尚未完全阐明。 mTOR信号通路异常激活被认为是多囊肾病发生的重要机制,新生血管的形成也可促进多囊肾病的进展；因此我们探讨罗格列酮对mTOR信号通路的作用,研究其对新生血管形成中起重要作用的血管内皮生长因子(VEGF)的作用；同时观察罗格列酮与mTOR抑制剂雷帕霉素联合应用对延缓ADPKD进展的作用,为治疗多囊肾病寻找新的途径。 为此,我们首先研究了罗格列酮对多囊肾囊肿衬里上皮细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的作用。多囊肾囊肿衬里上皮细胞系(WT9-12)由美国哈佛大学周晶教授馈赠。培养的WT9-12细胞给予不同浓度的罗格列酮培养24、48、72h,采用MTT法检测结果显示：罗格列酮明显抑制WT9-12细胞的增殖,呈时间、剂量依赖性。预72h时,50%抑制率浓度为100μM。采用流式细胞技术检测细胞周期及凋亡,结果显示罗格列酮明显抑制WT9-12细胞周期,使细胞停滞于G0／G1期,G0／G1期细胞增加30%,与对照组比较有差异有显著性意义(P0.05),其对细胞凋亡的影响不大,罗格列酮浓度高达200μM时,仅使细胞凋亡增加6%。多囊肾病的发展过程伴有胰岛素生长因子1(IGF-1)表达的增加,我们的研究发现囊肿衬里上皮细胞对IGF-1的刺激反应较其它永生化肾小管上皮细胞(RCTEC)更为明显。IGF-150ng/ml可诱导囊肿衬里上皮细胞增殖增加20%,而对RCTEC无明显影响。罗格列酮可完全抑制IGF-1诱导的WT9-12细胞增殖,该作用在罗格列酮12.5μM时即表现明显的抑制作用。说明罗格列酮在有IGF-1作用下对囊肿衬里上皮细胞的增殖抑制作用更为明显。 mTOR信号通路异常激活在多囊肾病发病及发展中起重要作用,为多种发病机制的共同环节,抑制mTOR信号通路可明显抑制多囊肾病的进展,p70S6K及4E-Bp1是mTOR两个主要下游底物。用不同浓度的罗格列酮作用WT9-12细胞24h,收集细胞,提取总蛋白,采用Western blot方法检测p-mTOR/mTOR及其下游p-p70S6K/p70S6K、p-4E-Bp1/4E-Bp1。结果显示罗格列酮下调p70S6K磷酸化水平,呈时间及剂量依赖性,而对mTOR及其另一个下游底物4E-Bp1的磷酸化水平无明显影响。mTOR特异性抑制剂雷帕霉素联合罗格列酮抑制p70S6K的磷酸化作用强于单用罗格列酮,不仅表明罗格列酮是不经由mTOR抑制p70S6K的磷酸化,且雷帕霉素联合罗格列酮可对mTOR信号通路下游p70S6K的磷酸化抑制有叠加作用,也为mTOR抑制剂雷帕霉素联合罗格列酮治疗ADPKD提供理论基础。 罗格列酮的作用有PPARy依赖和非依赖两种途径。为研究罗格列酮对多囊肾囊肿衬里上皮细胞mTOR/p70S6K信号通路的影响是否通过PPARy依赖途径,在给予PPARy特异性抑制剂GW9662预孵后再给予罗格列酮发现：GW9662仅部分抵消了罗格列酮对细胞增殖的抑制作用。同样,在给予GW9662抑制剂后再给予罗格列酮可抑制罗格列酮对p-p70S6K的下调效应,进一步采用siRNA干扰技术,将PPARy siRNA瞬时转染WT9-12细胞后,采用Western blot检测发现,罗格列酮仍部分抑制p70S6K的磷酸化,这些结果表明罗格列酮对细胞增殖抑制以及对mTOR/p70S6K信号通路的抑制作用可能部