方法开发报告2013-APP-RLC-016.PDFVIP

The world leader in serving science 方法开发报告2013-APP-RLC-016 UHPLC-MS 同时检测奶粉和母乳中十种核苷和核苷酸 赛默飞世尔科技色谱产品应用中心 检测项目 十种核糖核苷、单磷酸核苷酸 Thermo Ultimate 3000 系统串联TSQ Vantage MS： 泵：DGP-3600RS 自动进样器：WPS-3000RS 仪器型号 柱温箱：TCC-3000RS 检测器：DAD-3000RS and TSQ Vantage 色谱软件：Chromeleon 6.8 and Xcalibur 方法开发 曾明飞，张婷婷 审核人 金燕 时 间 2013.03.20-2013.04.01 1. 引言 核苷酸（Nucleotide）是核苷 （Nucleoside）和磷酸 （Phosphate groups）结合的化学物质， 其中核苷一磷酸是有代表性的一系列品种。多个核苷酸连接成锁状的物质由其含有核苷酸的数量 分为寡核苷酸 （15 个或少于15 个核苷酸）和多核苷酸 （15 个核苷酸以上），后者也是构成DNA （去氧核糖核酸）和RNA （核糖核酸）的单位，生物的细胞中都存在。因其具有相当的重要性， 对于核苷酸和核苷的研究已经成为目前生物医药，食品添加剂，母婴用品等方面的研究重点。 在一些临床研究发现，添加核苷酸的婴儿配方奶粉，可以减少腹泻的发生及促进较小胎儿的 生长发育。而牛奶中一般不含有核苷酸，且目前的婴幼儿配方奶粉国家标准中未规定这项指标， 但是根据核苷酸对婴幼儿的特殊功效，大部分的乳品企业都将其作为重要指标，因此建立简单方 便的检测乳制品中核苷酸的方法就显得迫在眉睫。 查阅文献发现，目前对于核苷酸和核苷的测定方法主要是基于HPLC-UV 或LC-MS 为主，尤其 是随着ＭＳ技术的普及，采用LC-MS 方法检测核苷酸和核苷已经逐渐成为主流[1-10] 。然而因为核 苷酸与核苷本身的物理化学性质导致其在采用LC-MS 检测是不可避免会产生局限性。因其强极性 [1] [7] 性质，导致其在常规的反相色谱柱上面往往不易保留，对此问题Coulier 等，Viñas 等和 Yamaoka [8]等采取添加离子对试剂或者Inoue 等[3]采用HILIC 的并且选择高浓度的（30 mM 甲酸 铵）缓冲盐。因此文献中报道的方法普遍存在的检测限过高问题，例如Ren [6]等采用LC-MS 同时 检测5 种核苷酸检测限都在0.01 μg/ml 以上，Inoue[3]等采用HILIC-MS 同时检测5 中核苷酸检 测限为0.005 μg/ml 以上。 The world leader in serving science 本方法结合已有的HPLC 方法，通过方法优化，使得能够同时十分灵敏 （0.02-1.0 ng/ml）时 测定奶粉中十种核苷酸和核苷 （包括AMP、IMP、UMP、CMP、GMP、A、I、U、C、G）的方法，并且 峰型良好，方法简单方便，与已发表文献相比具有相当的优越性易推广到应用到实际样品的测定 中。 2. 对照品和样品前处理 2.1 标准溶液配制 分别精密称量尿嘧啶核苷（U）、鸟嘌呤核苷（G）、腺嘌呤核苷（A）、肌苷（I）、胞嘧啶 核苷（C）、单磷酸腺苷（AMP）、单磷酸鸟嘌呤核苷（GMP）、单磷酸次黄嘌呤核苷（IMP）、单 磷酸尿嘧啶核苷（UMP）、单磷酸胞嘧啶核苷（CMP）固体粉末标准品5.0 mg 分别溶解于1 ml 去 离子水中，混匀，分别得到5.0 mg/ml 的十种标准溶液；结构如Fig 1. 取十种标准溶液不同