促性腺激素及IL6对卵巢癌细胞株核因子κB表达的影响论文.docVIP

　　促性腺激素及IL6对卵巢癌细胞株核因子κB表达的影响论文 【摘要】 目的：探讨促性腺激素及IL6对卵巢癌细胞株核转录因子κB（NFκB）表达的影响. 方法：应用不同剂量的人重组促性腺激素及人重组白介素6（hrIL6）与卵巢癌细胞株OVCAR3, Caov3共培养，应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验观测其对卵巢癌细胞生长的影响，同时应用RTPCR和ELISA方法检测卵巢癌细胞NFκB水平，以分析其信号传导途径. 结果：促性腺激素对卵巢癌细胞株具有促增殖作用,分别增加35％~202％（P＜0.05）；67.7％~192％（P＜0.01），并使细胞内NFκB亚单位表达增加1.53倍~3.98倍（P＜0.05），与对照组相比差异具有显著性. 在处理组卵巢癌细胞培养液中加入50 mg/L抗IL6中和性抗体,上述2种卵巢癌细胞株的生长均有所减慢，NFκB表达下降. 结论：提示促性腺激素对卵巢癌细胞株的促增殖过程可能由IL6介导，促性腺激素、IL6及NFκB共同影响卵巢癌细胞的生长. 【关键词】 卵巢肿瘤 促性腺激素 白细胞介素6 0引言 内分泌和免疫系统之间互相作用.freelega公司）.核提取试剂盒（Active Motif）. NFkB检测试剂盒（Active Motif）. FSH,LH,IL6,抗IL6中和性抗体（Sigma）. NFκB p50上游引物：5′CAC CTA GCT GCC AAA GAA GG3′，下游引物：5′AGG CTC AAA GTT CTC CAC CA3′，产物长度为399 bp；NFκB p65上游引物：5′TCA ATG GCT ACA CAG GAC CA3′，下游引物：5′CAC TGT CAC CTG GAA GCA GA3′，长度为308 bp.人IL6酶联免疫检测试剂盒（R D）. 1.2方法 取浓度为2×108/L对数生长期OVCAR3, Caov3细胞,加入96孔板中,每孔100 μL,每组6孔或每个T75细胞培养瓶加入4×105个对数生长期OVCAR3, Caov3细胞，37℃，50 mL/L CO2，饱和湿度培育24 h弃去培基，更换含有100 mL/L活性炭吸附的胎牛血清RPMI 1640培养基培养24 h,以去除原血清所含激素对细胞生长的影响. 1.2.1MTT实验检测卵巢癌细胞的增殖细胞培养基中加入相应的处理因素①促性腺激素（FSH/LH）终浓度：0，20，40，60，80，100 U/L；②不同终浓度促性腺激素（FSH/LH）及50 mg/L抗IL6中和性抗体，对照组只加入RPMI 1640培养基. 作用96 h，行MTT实验. 1.2.2细胞培养上清液中IL6含量检测ELISA法检测经不同浓度促性腺激素处理的卵巢癌细胞培养上清液中IL6含量. 1.2.3NFκB活性检测实验组分为两组. ①加入终浓度为100 μg/L的IL6或100 U/L的促性腺激素，②在加入IL6或促性腺激素的同时加入终浓度为50 mg/L抗IL6中和性抗体. 对照组只加入RPMI 1640培养基. 严格按照试剂盒说明书操作［1］，分别提取T75细胞培养瓶中卵巢癌细胞株细胞质及细胞核物质，-80℃冰箱保存以备用，使用ELISA法分别检测胞质与胞核中NFκB的含量；RTPCR法检测NFκB mRNA：采用Trizon试剂一步法提取总RNA. RTPCR反应条件：48℃逆转录45 min，94℃ AMV逆转录酶灭活/RNA/cDNA/引物变性2 min，PCR扩增条件为：94℃变性30 s， 56℃退火1 min，68℃延伸2 min，35个循环，68℃ 7 min(末次循环)，4℃保温. 反应结束后使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，以100 bp DNA Marker为分子大小标记,.freelRNA的相对表达丰度. 统计学处理: 数据以x±s或百分数表示, 采用SPSS11.0统计软件处理,两样本均数比较采用t检验, 2个以上样本均数的比较采用方差分析,多个实验组与一个对照组均数比较采用最小显著法（LSD）. 2结果 2.1卵巢癌细胞的增殖FSH可促进OVCAR3,Caov3细胞增殖. 当FSH浓度为40 U/L时, OVCAR3，Caov3细胞株较对照组细胞增殖率分别增加了35%和67.7% (P 0.05);当FSH浓度为100 U/L时,细胞增殖率较对照组细胞增了202%,192%(P 0.01). 在卵巢癌细胞培养液中分别加入50 mg/L抗IL6中和性抗体,2种卵巢癌细胞的生长均有所减慢. LH的结果与FSH的结果类似. 无免疫活性的兔IgG单