大口静灰球体外抑菌实验研究论文.docVIP

　　大口静灰球体外抑菌实验研究论文 翁丽丽，王淑敏，朱娜，宋启印 【摘要】 目的观察大口静灰球不同溶剂浸提液体外抑菌效果。方法以金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、绿脓假单胞菌、枯草芽孢杆菌为受试菌，采用对倍稀释法测定大口静灰球不同溶剂浸提液体外最低抑菌浓度(MIC)，并通过测定平板内抑菌圈直径观察其体外抑菌效果。结果实验表明，95%乙醇、醋酸乙酯、三氯甲烷浸提液对以上4种细菌均有不同程度的抑制作用。结论大口静灰球具有一定的抑菌作用，可用于抗菌药物的研究开发。 【关键词】 大口静灰球; 体外抑菌 马勃是一种常见的用于消肿、解毒和止血功用的药用真菌.freelonas aeruginosa，ATCC10105;枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，History ← ISF ← AS 1.21，由长春中医药大学微生物实验室提供。 1.3 药品和试剂95%乙醇、醋酸乙酯、三氯甲烷、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、琼脂粉、医用酒精等(皆为分析纯)。 1.4 仪器YXQ-I，S.50S II立式高压蒸气灭菌器; METTLE TOLEDO型电子天平;HG303.4K电热恒温培养箱;DHG.9070A型电热恒温鼓风干燥箱 ;B.1360型生物洁净工作台 ;KQ-250DB型数控超声波清洗器;PH B-4便携式酸度计。 2 方法 2.1 供试细菌培养 2.1.1 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基制备液体培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1 000 ml加热溶解，调节pH 7.0～7.2。固体培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1 000 ml，琼脂20g，加热溶解，调节pH 7.0～7.2，于121℃高压蒸气灭菌30 min后制备细菌平板培养基3，4。 2.1.2 供试菌液的制备将各菌种分别接种到已标好菌种名称、株号、日期的斜面试管上，然后于37℃恒温培养箱中培养24～48 h。挑选生长在琼脂上的纯菌落，直接用0.9%生理盐水稀释比浊到3号麦氏比浊管，浓度(9×108 cfu/ml)，再1∶10稀释，制备好的供试菌液备用。 2.2 4种溶剂浸提液抑菌原液的制备将干燥的大口静灰球子实体剪去根部，保留不孕基部，粉碎后分别称取5 g分装于250 ml的三角烧瓶中，分别用100 ml的水、95%乙醇、醋酸乙酯、三氯甲烷浸渍24 h，超声(温度40℃、频率60Hz)30min后抽滤，重复浸提3次，合并相同溶剂浸提液，回收溶剂至剩余量大约5ml，移入已称重的小安瓿瓶中，于60℃水浴浓缩，后60℃烘干，称重，计算大口静灰球子实体以不同溶剂超声浸提的得率，分别为3.056%，2.901%，1.212%，0.936%。分别吸取2 ml相应的溶剂，作为子实体抑菌原液备用。以上4种溶剂浸提液的抑菌浓度分别是76.40，72.53，30.30，23.40 mg/ml。以无菌水、95%乙醇、醋酸乙酯及三氯甲烷各2 ml为阴性对照。 2.3 抑菌圈法测定大口静灰球4种溶剂浸提液的抑菌效果将已制好的菌悬液0.1 ml接种于平板上，用无菌刮铲涂匀,盖好平皿，做好标记，放置 5 min，待平板表面水分吸收后，用直径5 mm无菌金属打孔器在平皿内打孔，每皿3个孔,除去洞内琼脂，分别用微量移液器吸取40 μl 4种大口静灰球浸提液及相应阴性对照空白溶剂至孔中，以溶剂充满整个孔为宜，每皿3个孔为相同大口静灰球浸提液或者空白溶剂，并重复实验两次。将培养皿置于37℃恒温培养箱中培养24～48 h后，取出观察，用游标卡尺测量并记录抑菌圈直径，试验重复3次，计算各样品抑菌圈直径平均值5。 2.4 最低抑菌浓度(MIC)的测定取无菌小试管40支排于试管架，于每行第1管加入牛肉膏蛋白胨液体培养基0.8 ml，2～10管各加0.5 ml，于121℃高压蒸气灭菌30 min后备用。于每行第1管分别加入大口静灰球4种溶剂浸提液0.2 ml，混匀后取0.5 ml加入第2管，依次倍比稀释，自第9管吸出0.5 ml弃去，第10管系对照管。将各试管中加入以上菌悬液0.05 ml，混匀后放置37℃培养24～48 h，观察结果。以药液最高稀释管中无细菌生长者，该管的浓度即为该细菌对此药物的敏感度，即MIC6，7。 3 结果 3.1 大口静灰球4种溶剂浸提液的抑菌结果大口静灰球子实体的水、95%乙醇、醋酸乙酯和三氯甲烷4种溶剂浸提液，阴性对照无菌水、95%乙醇、醋酸乙酯和三氯甲烷溶液，对金黄色葡萄球菌,.freelm，小于15 mm，抑菌效果较好;对枯草芽孢杆菌三氯甲烷浸提液抑菌圈直径大于10 mm，小于15 mm，抑菌效果较好。醋酸乙酯和95%乙醇浸提液φ大于5 mm，小于10 mm，抑菌效果稍次;