基因治疗病毒载体的纯化.PDFVIP

GE医疗中国 层析介质应用 GE 生命科学部填料应用部 基因治疗病毒载体的纯化 简介 基因治疗是指用正常或野生的基因矫正或置换致病基因的 离心法相比，腺病毒层析纯化法更容易以低成本安全、直 治疗方法。基因治疗利用载体将起治疗作用的基因导入靶 接的放大到工业规模生产。现今最有效的纯化工艺如下： 细胞，使其与宿主染色体整合为一体或在宿主细胞中表达， 从而起到治疗的作用。 细胞培养 病毒接种 细胞收集 基因治疗载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类，常 用的病毒载体有逆转录病毒载体 （Ret roviral vectors ），腺 病毒载体AdV （Adenovirus vectors ），腺相关病毒载体AAV Q Sepharose XL 捕获 过滤 （Adeno-associated virus vectors ），慢病毒载体Lentivirus vectors ）和单纯疱疹病毒载体HSV （Herpes simplex virus ） 等。常用的非病毒载体主要有质粒DNA 和反义核酸。 Source 15 Q 精纯 Sepharose 4 FF 成品 图1 ：腺病毒纯化工艺。 一、反转录病毒纯化 反转录病毒颗粒为球形，直径约为100nm ，含有两条单链 的RNA ，长度在8-11kD 之间，氯化铯超速离心的密度为 1.16-1.21g/cm3 之间。目前纯化反转录病毒颗粒的方法有： •中空纤维滤膜 （100KD）超滤，操作简单，回收率较高 90% ； •分子筛层析，Se pha rose C L-4B 或者Se pha rose 4 Fast Flow ，可高效的纯化反转录病毒 （1，2 ，3 ） 。 图2 ：利用Q Sepharose XL 柱纯化腺病毒载体。 二、腺病毒AdV 纯化 腺病毒是一个20 面体的无包膜双链DNA 病毒，直径70-90nm， 3 三、腺相关病毒AAV 纯化 含有14 种蛋白，氯化铯超速离心的密度为1.34g/ c m 。利用 层析技术纯化腺病毒已成为规模生产放大的首选方法，与 腺相关病毒属于微小病毒科，无包膜20 面体结构，病毒颗 粒直径20-26nm ，含有4.7-6kd 线状单链DNA 。重组腺相关 病毒去除了野生病毒96% 的基因。传统方法是氯化铯密度 梯度超速离心法，后续发展出AAV 单抗偶联成AAV 亲和层 （4 ） 析柱、肝素亲和层析和氯仿抽提等方法纯化AAV-2 载体 。 但是，氯化铯和氯仿均为有毒试剂，在生产中具有潜在的 危害；单抗、肝素均为外源蛋白，其残留量需要严格的检测， 增加了质检项目和工艺验证成本。目前较稳定的工艺为两 步离子交换法 （SP Sepharose HP; Source 15Q ），使用常规 层析介质和试剂，无需检测外源蛋白质等污染物残留（5 ，6 ）。 具体的工艺流程如下： 细胞培养 病毒接种 收集 离心 图6 ：利用强阴离子层析柱HiTrap ™ Q ，HP 纯化重组慢病毒病毒。 SP Sepharose HP 超滤 热处理