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* * * 试验一 外周血白细胞中DNA的提取与检测 1.掌握真核细胞中DNA制备原理。 2.熟悉从外周血白细胞中提取DNA的方法。 3.掌握紫外分析仪检测DNA的原理。 一、实验目的 二、实验原理 破碎细胞 DNA提取 检测 STMT破碎红细胞及白细胞的细胞膜→离心收集白细胞核→SDS破膜 苯酚氯仿抽提、乙醇沉淀洗涤 琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪检测 三、仪器试剂 1、主要器具 Eppendorf离心管 电泳槽与电泳仪 紫外分析仪 台式离心机 微量移液器 2、主要试剂 STMT：（蔗糖、Tris-HCl、MgCl2、TritonX-100） NE： （NaCl、EDTA Na2） TE： （Tris-HCl、 EDTA Na2 ） SDS 苯酚 氯仿 乙醇：无水乙醇、70%乙醇 四、操作步骤 吸去血清，混匀含有EDTA Na2的抗凝全血→取0.3mL至EP管（1）→加1mLSTMT，混匀→离心（12000rpm 1-2min），弃上清→加1mL0.9% NaCl洗涤离心,弃上清（12000 rpm 1-2min）→加460 μ L NE ,充分吹散沉淀→加35 μ L 10%SDS，轻轻混匀。 1、破碎细胞： 2、DNA提取： 加等体积苯酚，轻摇1min→离心（12000rpm 3-5min）→吸取上层水相于另一EP管（2） →加1/2体积苯酚+1/2体积氯仿-异戊醇，轻摇1min →离心（12000rpm 1min）→取上层水相于另一EP管（3）→加等体积氯仿-异戊醇→离心（12000rpm 1min） →取上层水相于另一EP管（4） 3、沉淀DNA 加1/10体积3M NaAC，混匀→加1mL无水冰乙醇→置-20℃冰箱，0.5-1h →离心 （12000rpm 5min） →弃上清→加70%冷乙醇1mL洗涤→离心（12000rpm 5min） → 弃上清→自然干燥→加50 μ L TE溶解，室温1h。 4、电泳 制胶：0.8%的琼脂糖凝胶（琼脂糖0.32g+TBE40ml，混合，加热熔化，冷至60℃，加EB20 μ L,制胶） 加样：DNA样品10 μ L +载样缓冲液2 μ L，混匀，取10 μ L点样 电泳：点样端接负极，100V，40min 紫外分析仪下观察结果 电泳结果图 * * *
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