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细菌耐药表型的检测方法 细菌耐药表型的检测 一、β-内酰胺酶的检测 （1）头孢硝基噻吩显色法（Nitrocefin）：制配纸片→灭菌水湿润→涂测试菌于纸片上，10min观察纸片颜色，显红色为阳性（葡萄球菌应放置1h内观察）。 （2）酸度法：青霉素→β-内酰胺酶水解→青霉酸、pH6.8以下→酚红指示剂由红色（构橼酸钠缓冲液pH8.5）变为黄色。 （3）碘测定法：β-内酰胺酶破坏β-内酰胺环，碘与破坏后的β-内酰胺结合，使兰色的淀粉—碘复合物转变成无色。 （4）仪器测定法：Vitek、Microscan的药物测试卡中均带有检酶功能。 二、ESBLS检测 （1）纸片扩散初筛：头孢他啶（30μg/片）抑菌圈≤22mm 头孢噻肟（30μg/片）抑菌圈≤27mm 头孢曲松（30μg/片）抑菌圈≤25mm 氨曲南（30μg/片）抑菌圈≤27mm （2）肉汤稀释法：上述药物MIC≥2μg/ml可疑为ESBLS。（表型确证试验：对2个任何一个药物MIC，在加克位维酸比不加克拉维酸的MIC值降低3个以上对倍稀释度判为ESBLS）。 （3）双纸片协同确认试验： 头孢他啶（30μg/片）与头孢他啶（30μg）/克位维酸（10μg） 头孢噻肟（30μg/片）与头孢噻肟（30μg）/克拉维酸（10μg）两纸片抑菌圈相比≥5mm即为ESBLS。 （4）E-test法（浓度梯度法）：由瑞典AB Biodisk公司研究生产，广洲贝肯公司经销。试条中的三代头孢菌素或氨曲南的MIC≥2μg/ml即可疑为ESBLS。 （5）仪器测定法：Vitek,microscan和BD-PHOEMXTM微生物分析仪均可测试ESBLS。 （6）利用分子生物学技术（PCR、DNA探针等）及分析酶底物谱及抑制物谱、生物化学技术等检测技术可对ESBLS做出确诊。 三、Ampc酶检测 1.初筛： （1）头孢西汀（30μg/片）与头孢西汀（30μg）/邻氯西林（200μg）。后者比前者的抑菌圈≥5mm即疑为Ampc。 （2）5种纸片筛选：马斯平、泰能、头孢西汀、头孢他啶与头孢他啶/克拉维酸。如头孢西汀≤18mm，对马斯平、泰能敏感即疑为产Ampc，如头孢他啶与其酶抑制剂的抑菌圈≥5mm可能产ESBLS。 2.确认试验（头孢西汀三维水相试验法） AmpC酶新的检测方法 3.三维水相试验方法的改进 （1）将标准菌株ATCC 25922按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。 （2）在M-H平板中心贴一片头孢西汀(30ug/片) 纸片，在距纸片边缘1cm处，用无菌手术刀片切3cm长度的小槽，将待测菌株的6个菌落接种于槽内(勿溢出槽外)，35℃孵育18-24h。 （3）结果观察：若抑菌圈向内凹陷，即AmpC酶阳性。 ※三维水相试验方法的改进(M-H平板打孔[2mm]扩散法). AmpC酶新的检测方法 4.质粒型AmpC酶三联纸片方法的检测 （1）将标准菌株ATCC 25922按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。 （2）在M-H平板中心贴一片头孢西汀(30ug/片) 纸片，在纸片边缘贴有待测菌的纸片（纸片上含20ul， PH8.0，1M Tris-0.1MEDTA）。 （3）另一侧边缘贴有产AmpC酶菌的纸片（同上）。 （4）35℃孵育18-24h，如待检菌出现扁平或凹陷的抑菌环为阳性。 四、金属β-内酰胺酶的表型检测方法 1.头孢他啶+2-巯基丙酸法(CAZ+NCA) （1）将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。 （2）在M-H平板上分别贴两片头孢他啶(30ug/片)纸片，纸片中心相距2.5cm,将其中一片头孢他啶纸片上加3ul 2-巯基丙酸，35℃孵育18-24h。 （3）结果观察：若加有2-巯基乙酸的头孢他啶纸片抑菌圈大于单个头孢他啶的抑菌圈（≧4mm），则为阳性，即产金属β-内酰胺酶。 金属β-内酰胺酶的表型检测方法 2.亚胺培南+EDTA法(IMP+EDTA) （1）将待测菌株按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。 （2）在M-H平板上贴一片亚胺培南(10ug/片) 纸片，在距亚胺培南纸片中心1.5cm处贴无菌空白纸片一片，将0.5M EDTA 10ul 均匀浸注于空白纸片上，35℃孵育18-24h。 （3）结果观察：若两片纸片抑菌圈有协同作用，则为阳性，即产金属β-内酰胺酶。 五、肠杆菌科碳青霉烯霉筛选和确证（2009年CLSI:M100-S19.APPB.124） 1.如果菌株对碳青霉烯类药物表现为“I”或“R”没必要再去检验该酶，（医生通常不会选用“I”或“R