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生物工业下游技术 第四章 微生物细胞破碎 微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数小分子代谢物、细菌产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖化酶等，称为胞外产物。但有些目的产物存在于细胞内部、如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等，称为胞内产物。 许多基因工程产品都是胞内产物。分离提取胞内产物时，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。因此细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤。 1.直接测定法 2. 目标产物测定法 3. 测定导电率 不宜采用高压匀浆法的微生物： 易造成堵塞的团状或丝状真菌， 较小的革兰氏阳性菌， 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀） ②影响细胞破碎的因素 b.珠体的装量 （3）超声波破碎法 （3）超声波破碎法 超声波破碎法在实验室和小规模生产中应用较广。操作时常应把悬浮液预先冷却到0～5℃，并且还应在夹套中连续通入冷却剂进行冷却。 细胞破碎方法： 选择破碎方法时，需要考虑下列因素： 血球计数板的使用 /v_show/id_XOTQzODY4MjQ=.html （1）酶溶法（Enzymatic Lysis） ①外加酶法 常用的溶酶 G+ 溶菌酶、适量抑制剂 G- 溶菌酶、EDTA 放线菌 溶菌酶 酵母菌 β-葡聚糖酶 霉菌 几丁质酶、 植物 纤维素酶、半纤维素酶 细胞壁溶解酶是几种酶的复合物 选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。 溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。 在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。 酶溶法的优点： 酶溶法的缺点： 缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。 （2）自溶法（Autolysis） 诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。微生物细胞的自溶常采用加热法和干燥法。 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、缓冲液浓度和细胞代谢途径等。 某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。 （2）化学试剂破碎法（Chemical permeation） 该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。 用碱处理细胞，可以溶解除去细胞壁以外的大部分组分。酸处理可以使蛋白质水解成游离的氨基酸。 如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。 其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠、吐温等也可使细胞破碎。 表面活性剂 可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。 处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。 EDTA螯合剂 能溶解细胞壁中的磷脂层，使细胞破坏。 有机溶剂 变性剂 盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲（Urea）是常用的变性剂。 常用的有机溶剂：丁酯、丁醇、甲苯、二甲苯、氯仿及高级醇等。 变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。 通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50% 有些化学试剂有毒 。 化学法的优点： 缺点： 对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。 细胞破碎方法（按是否使用外加作用力） 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活 改变细胞膜渗透性 干燥法 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物 反复冻结-融化 冻结融化法 破碎率较低，常与其他方法结合使用 渗透压剧烈改变 渗透压法 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差 改变细胞膜的渗透性 化学渗透法 具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差 酶分解作用 酶溶法 非 机 械 法 破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合 固体剪切作用 X-press法 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作 液体剪切作用 超声破碎法 可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌 液体剪切作用 高压匀浆法 可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，