基因工程-3.ppt

病虫害与农药施用 病虫危害重，防治面积大，喷药次数多。 我国农药年用量为43万吨，相当于美国的4倍。 加重了农民负担，严重破坏生态环境。 农药残留普遍严重超标，严重影响农产品的出口和危害健康。 作物生产中的过量施肥问题 我国每年施用肥料4000多万吨，为美国用量的2倍，而耕地面积不到美国的2/3。 肥料利用率低（平均约30％）。 加重农民负担，造成土壤退化、江河湖海的富营养化。 影响作物品质 作物生产中水资源的问题 农业用水太多(约占全国总耗水的70％，水稻约占农业耗水的70％) ，水资源日趋短缺，旱灾频繁。 全国受旱面积常年在7亿亩以上，按每亩减产粮食100斤计，损失相当于2个湖南省的总产量。 北方灌溉面积占47％，总灌水量470亿立方米，若作物用水效率(耐旱能力)提高10%，节省用水量相当于一条黄河。 土壤逆境 全国约有5亿亩盐碱地。 热带、亚热带普遍为酸性土壤，铝离子毒害。 限制作物的种植。 产量、品质需改进 作物的品质有待改进。 近二十年来各主要作物产量均现徘徊局面。 转基因技术与我国农业科技革命 我国农业科学家提出第二次绿色革命：少投入、多产出、保护环境。 转基因技术将对我国农业科技革命的实现起决定性作用。 双元载体 农杆菌工程菌的制备过程：将载有外源基因的小质粒引入含卸甲的大Ti质粒的菌株，组成含两个质粒的转化菌株。T-DNA介导外源基因转移是利用反式激活原理。 （2）Ri质粒载体系统 Ri质粒：200kb-800kb，其基本结构也与Ti质粒相似，包括致瘤区（Vir区）、T-DNA区和复制起点Ori。 ? 根据其合成的冠瘿碱种类的不同可分为三类：农杆碱型、甘露碱型和黄瓜碱型。 ? 农杆碱型Ri质粒有两段T-DNA，即TL和TR，可以分别插入植物基因组； ? 甘露碱型和黄瓜碱型Ri质粒只有单一T-DNA。甘露碱型和黄瓜碱型Ri质粒的单一T区除其25bp边界重复序列外，其他部分与Ti质粒同源性很低，但它们与农杆碱型Ri质粒的TL区有较高的同源性。 Ti质粒作为载体进行基因转化时，必须首先解除“武装”。然而，Ri质粒的T-DNA上的基因不影响植株的再生，野生的Ri质粒直接可以用作转化载体。 Ri转化载体也有两种构建策略: 共整合载体：与Ti质粒的共整合载体的不同之处是可直接利用野生型的Ri质粒。 双元载体：与Ti质粒相同，其原理主要是Ri质粒的Vir基因反式作用驱动T-DNA转移。 3、病毒载体 一个有效的植物基因转化载体必须具备两种功能：①它能作为媒介将外源基因导入植物细胞，并且整合到宿主细胞的基因组DNA上；②它能提供被宿主细胞的复制和转录系统所识别的DNA序列，即启动子和复制子起始位点，以保证转化的外源基因能在植物细胞中进行复制和表达。 植物病毒作为载体的研究仍处于初级阶段，其原因： 1）绝大部分的植物病毒尚未发现像动物细胞逆转录病毒那样能整合到宿主基因组中。 只能以游离形式存在其中，而不能整合到植物染色体上并通过有性繁殖传替给后代。 2）由于高效的农杆菌Ti质粒转化系统的研究热点，忽视了植物病毒载体的发展。 近年来对植物病毒的基因组结构、功能以及病毒作为基因载体的研究有了较大进展；特别是发现CaMV病毒的35S启动子是理想的高效表达启动子，并已经在植物基因工程中得到广泛应用。许多科学家已经认识到植物病毒是一种有希望的潜在基因载体。 较有希望的是双链DNA的花椰菜花叶病毒（CaMV）和RNA病毒。 （1）病毒载体系统的基本条件 1）病毒的核酸中应该包含一个在农艺上有用的性状基因，或者可以通过DNA重组技术在病毒的核酸中插入一个有用的基因。 2）作为载体的病毒本身必须是既能正常地在植物细胞中复制增殖，又不致于扰乱宿主的正常生理功能。 3）接种方法必须简单可行，以适合较大规模的实践应用。 4）病毒基因能耐受修饰和改造以改变某些生物学特性；主要目标之一是减弱或消除病毒的致病性。 5）病毒基因组能耐受插入报告基因、目的基因等，同时又不改变其侵染性。 （2）病毒载体系统的选择策略 1）选择病毒载体的标准：寄主范围广、感染力强、传播方式简单等；还包括病毒携带外源遗传信息的能力。 因为对于大多数病毒来说，衣壳的容量限制了其包装额外遗传物质的潜力，就这一点而言，那些具有细长形状或棒状衣壳的病毒，或者具有多份基因组，可以分别进行包装的各类病毒通常更有希望容纳大的外源核酸；另一种办法是选用那些不需要包装也可以感染植物细胞的RNA病毒，如TMV。 2）另一个重要标准是病毒核酸的相应DNA克隆具有感染植物的能力。 目前知道的具有这一特性的病毒是一类花叶病毒的双链DNA病毒；另一类有可能具有应用价值的是具单链DNA的geminivirus，因为其具有广