第01篇-经典实验技术(1.2).pptVIP

对于熟练操作者，左手以无齿镊子捏住心尖部，右手用眼科剪刀在心尖部剪开左心室，迅速将灌注针插入左心室直至升主动脉，用止血钳夹住灌注针，调整灌注针角度使灌注液顺利灌入，然后将右心耳剪破，放出体内血液。待右心耳流出清流液体后，即表明动物经灌注后体内已无残留血液。一般大鼠灌注200~300ml、小鼠100ml、家兔500~600ml即可达到良好的灌注效果。如需进行固定，则在灌注后继续灌注固定液，一般大鼠灌注200~300ml、小鼠100ml、家兔500~600ml即可达到良好的固定效果，此时动物的四肢、尾、颈部均已僵硬，停止灌注固定，然后即可根据需要取材。 三、脱水和透明 1．光镜切片 脱水即是将固定后的组织内水份脱掉，透明是将组织在浸蜡之前，在苯类物质中呈现出透明现象，透明的好坏直接影响浸蜡的效果。常规脱水剂为酒精，透明剂为二甲苯。脱水是为浸蜡，因为水不溶于蜡；透明是为了置换脱水剂，因为二甲苯置换究竟后可与石蜡相容。组织脱水和透明的时间应根据组织块的大小而定，在透明过程中可随时观察，直至使组织完全透明为止。对于1.5cm×1.5cm×0.2～0.3cm的组织块，一般常规梯度酒精脱水2～4h,二甲苯透明30min, 如果将酒精在温箱中加温，可适当缩短脱水的时间。 2．电镜切片 用于电镜观察的生物标本在包埋之前必须彻底脱水。目前常用的脱水剂有酒精、丙酮和环氧丙烷。 四、浸蜡和包埋 1．石蜡包埋 将组织从透明剂中取出，投入熔蜡箱中的软蜡（熔点52~54℃），然后入硬蜡（熔点56~60℃）浸蜡。组织块不能在熔蜡中停留时间过长（1h)，温度不能超过65℃。浸蜡前必须使组织块彻底脱水。 石蜡充分浸入组织块之后，即可进行包埋。包埋的方法很多。若组织块较小，在包埋铸块盒（或自制简易纸盒）内面涂少许甘油，然后徐徐倒入石蜡。用小镊子夹住组织块迅速放入石蜡中。拿组织块时，不能停留在空气中时间过长，以免组织块表面的石蜡凝固，造成组织块与包埋石蜡不能融合。包埋好的蜡块，修整保存。 2．环氧树脂包埋 目前电镜超薄切片普遍使用的是环氧树脂 五、切片和贴片 组织病理学技术是利用不同的染料使组织着色，然后利用显微镜，通过光学原理观察组织细胞的细微结构变化，所观察的标本必须能透过自然可见光。所以，必须将不透光的大组织块首先切成很薄的切片，这就是组织切片技术。 （一）石蜡切片 1．玻片准备 玻片要用肥皂水充分清洗，泡酸24h，然后流水冲洗，再用蒸馏水清洗， 2. 贴片前将粘片剂（一般用多聚赖氨酸，也可用APES或明胶等）均匀涂于玻片的一端（磨砂片的光滑端），放入温箱烤干后备用。 3．切片刀准备 切片前应将切片刀磨好。在低倍显微镜下观察，刀刃如呈一条光滑的直线，说明刀刃锋利 4．切片和贴片 切片时多使用轮转式切片机，使用时左手执毛笔，右手旋转切片机转轮。先修出标本，直到组织全部暴露于前面为止。切片厚度一般5~15μm，常规为5μm，切出蜡片后，用毛笔轻轻托起，正面向上放入展片箱（展片温度根据使用的石蜡熔点进行调整，一般低于蜡熔点10~20℃），待切片展平后，即可进行分片和捞片。 捞片时注意位置，要留出标签的空间，并注意整齐美观。捞起切片后，立即写上编号。切片捞起后，在空气中略微干燥后即可烤片。一般在60℃烤箱内烤30min即可，也可用烤片器烤片。 （二）冰冻切片 用于冰冻切片的组织取材后可直接进行切片，也可置于液氮冷藏备用，冰冻切片省略了石蜡切片过程中的组织脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤，不仅节省了时间，有利于临床快速诊断，而且避免了上述过程造成的组织成分的丢失和破坏，因此，更适用于免疫组化和原位杂交染色等微量活性物质的检测。冰冻切片的厚度一般为10~30μm 。 1．恒冷箱切片 将组织在恒冷箱的切片机上切片。一般调节温度为-25℃左右。箱内温度下降后，打开观察窗，将组织固着器放置到速冻台上，先放置少量OCT或羧甲基纤维素，待冻结后将组织块放上，并在其周围加适量包埋剂，将组织块包埋。初步修出组织切面后，开始切片。切出切片用载玻片粘附后，进行吹干或固定，保存备用。 2．半导体制冷冰冻切片法 组织块放在半导体制冷台上，加少许蒸馏水，调好切片的厚度。接通循环流水后，再接通电源，而且在使用过程中流水不能中断，关闭电源后，才能停水。冰冻组织周围的水不宜过多，用手检查组织块的硬度，当可以切成厚薄一致的切片时，即可切片。切片用毛笔展平后，立即用载玻片粘附，待