分子实验步骤.docxVIP

报告一：克隆基因、筛选与表达 PCR基因扩增及扩增产物的回收 一、PCR扩增目的基因AKP 反应体系（50uL）： ddH2O 35.7uL 2.5mmol/L dNTP 4uL 10xbuffer 5uL 引物 sense（10umol/mL）2uL Antisense 2uL 模板DNA 1uL Ex－Taq E 0.3uL（1.5U） 注：最后加酶。 配体系时的注意事项：将体系各成分加入管底；充分混匀；离心；冰上操作；保证管内无气泡；注意换枪头，防止交叉污染。 参数设定： 940C,5’ 30次 940C,1’ 变性 550C,1’ 退火 720C,2’ 延伸 720C,10’补齐 二、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 1、凝胶配制： 0.8%琼脂糖凝胶 30mL (用1xTAE配) ；1.5uL GoldView；微波炉加热；倒胶插梳子；注意尽量去除气泡。 2、加样：50ulPCR扩增产物+6ul 10×loading buffer. 3、电泳：恒压80V。 4、凝胶成像仪或紫外透射仪观察记录电泳结果。 三、扩增产物的回收 1. 切胶、称胶重,每100mg胶加入700uL溶胶液，550C溶胶(一定要完全溶解)。 2. 装柱，12000rpm离心30秒，去除废液。 3. 漂洗:500uL漂洗液，12000rpm,30秒漂洗一次，去除废液,重复漂洗一次。 4. 12000rpm,2分钟，换成干净的无菌1.5mL小管。 5. 向柱子的正中央加20uL洗脱buffer或无菌水，放置5分钟。 6. 12000rpm,30秒。 7.向柱子的正中央加10uL洗脱buffer或无菌水，放置5分钟。 8. 12000rpm,2分钟。 9. SYBR检测回收产物 质粒DNA的提取及其定性定量分析 质粒DNA的提取 接含pETBlue-2质粒的单菌落于4mL含羧苄（50ug/mL ）和四环素（12.5ug/mL）的LB液体培养基中，370C，190rpm振荡培养过夜； 4000rpm、离心1min，弃去上层培养液收集所有菌体于一个小指管中； 150uL溶液I悬浮菌体（旋涡混匀），室温10min ； 加入200uL溶液II（轻轻混匀!裂解时间不超过5min），室温静置菌液裂解变清； 加入200uL溶液III（轻轻混匀!），冰上静置15min质粒DNA复性 12000rpm，离心10min取上清 上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（旋涡混匀） 12000rpm，离心5min取上清 上清加等体积的氯仿：异戊醇（旋涡混匀） 10、12000rpm，离心5min 11、上清加2倍体积的无水乙醇（旋涡混匀），室温 30min 12、12000rpm，离心10min 13、沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心） 14、12000rpm，离心5min 15、沉淀于超净台中风干 16、沉淀加入20uL RTE，600C水浴30分钟溶解 17、-200C保存 质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析 1%琼脂糖凝胶 20mL (用1xTAE配) 1xTAE 120mL 2uL质粒DNA + 0.5 uL 10xloading 80伏恒压电泳 结果用凝胶成像仪分析照相 质粒DNA的紫外吸收分析 质粒DNA用TE缓冲液稀释200倍（总体积300ul），测定A260和A280. 限制性酶切和链接 质粒DNA和目的DNA的双酶切 酶 切 反 应 体 系（ 20 uL ）管号核酸10xbuffer K ddH2O BamHI HandIII tube1目的基因 AKP 24 uL3 uL 0 uL2 uL 1 uL tube2pETBlue-2 10 uL 2 uL 5 uL2 uL 1 uL  37℃保温3小时。 酶切产物的纯化和回收 1%琼脂糖凝胶 25mL (用1xTAE配) 1xTAE 120mL 酶切DNA 4ul + 0.5 uL 10xloading 未酶切质粒DNA 2ul + 0.5 uL 10xloading Maker 5ul 80伏恒压电泳 结果用凝胶成像仪分析照相 接着进行扩增产物的回收，每100mg胶用700ul溶胶液来溶解，步骤同第一个实验中扩增产物的回收。 载体和AKP的连接 连接反应体系（20ul）目的基因AKP载体pETBlue-2 10xLigase buffer ddH2OT4DNA连接酶14ul2ul2ul