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Southern或 HYPERLINK /view/575027.htm \t _blank Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是 HYPERLINK /view/320392.htm \t _blank 聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 western blotting 实验试剂 1 　　30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺 　　将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。 　　小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。 2 　　4×Tris·Cl/SDS, pH8.8, 　　在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH至8.8, 补加H2O至体积500ml。用0.45um滤膜过滤溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。 3 　　4×Tris·Cl/SDS, pH6.8, 　　在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH至6.8, 补加H2O至体积100ml。用0.45um滤膜过滤溶液，再加入0.4g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。 4 　　4×SDS电泳缓冲液 　　Tris base 24.2 g 　　Glycerin 115.3 g 　　20%SDS 20 ml 　　加水至总体积1000ml。 　　应用时稀释4倍即为1×SDS电泳缓冲液(Tris 0.05M, Glycerin 0.38M, SDS 0.1%)。 5 　　TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺) 　　TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺的聚合。 6 　　10%过硫酸铵 　　过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和亚甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去离子水配制小量10%(w/v)的贮存液并保存于4???。由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。  HYPERLINK /view/1003510.htm 编辑本段步骤 　　1）按厂商的使用指南用两块干净的玻璃，平板和0.75mm垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶支架上。 　　2）按表7.1配制分离胶液体并脱气，然后加入10％的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌混匀。 　　表7.1 聚丙烯酰胺分离胶的配制 　　试剂成分 配制不同浓度分离胶所需试剂(ml) 　　5% 8% 10% 12% 15% 　　Acry:Bis (30:0.8) 2.50 4.00 5.00 6.00 7.50 　　4×Tris·Cl/SDS, pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 　　H2O 8.75 7.25 6.25 5.25 3.75 　　10%过硫酸铵 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 　　TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 　　按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5％的凝胶可用于60～200kDa的SDS变性蛋白质分子的分离，10％用于16～70kDa，15％用于12～45kDa。 　　3）用一根 HYPERLINK /view/33424.htm \t _blank 巴斯德吸管立即将分离胶液体沿夹层中一条垫片的边缘加入于玻璃平板夹层中，至凝胶约5cm高为止。样品体积少于10μl不需灌制积层胶。 　　4）用另一根巴斯德吸管，先从一边的垫片，再从另一边垫片往夹层的液面顶部缓缓加入一层水饱和异丁醇（厚约1cm）。让凝胶在室温聚合30min。 　　聚合后，可见在顶层异丁醇与凝胶的界面间有一清晰的折光线，胶的聚合失败往往问题在于过硫酸按或TEMED，或两者都有。 　　5)倾去顶层的异丁醇，并以1×Tris-Cl/SDS, pH8.8缓冲液冲洗凝胶的顶部表面,尽