第七章 细胞重组及细胞融合.ppt

* * 第七章 细胞重组与细胞融合 一、细胞重组 二、细胞融合 一、细胞重组 （一）概述 1 概念 通过一定的实验技术，从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其装配成具有生物活性的细胞或细胞器，又称细胞拆合。 2 特点 细胞重组最初只在细胞核、质之间的移植，现在发展到可以人为的对细胞任何的不同组分进行组合，大大扩展了在细胞工程研究中的应用。 3 意义 1）研究核质关系 2）研究细胞器的功能及相互作用关系 3）研究细胞器的组装，甚至细胞的自我装配机理，以揭示细胞起源与进化的机制。 4）结合基因转移技术，可人为地使细胞表达新的性状和产生新的产物，实现掌握细胞、利用细胞、改造并进而创造出具有特定性状和功能的工程细胞。 （二）细胞重组技术 ★细胞重组的方式及有关概念 1）胞质体与完整细胞的融合形成胞质杂种； 2）微细胞与完整细胞的融合形成微细胞异核体； 3）胞质体与核体（小细胞）融合形成重组细胞（核质杂种） 胞质体（cytoplast,cytosome)：除去细胞核后由细胞膜包裹的结构。 小细胞（minicell ）：又称核体，具有细胞核、带有薄层细胞质。 微细胞（microcell）：含有一个微核（仅有一条或几条染色体）并带有薄层细胞质。 1 显微操作技术 在显微镜下或借助于显微操作仪，用细微玻璃针或微吸管、微电极等对细胞进行人为操作。 2 细胞分离技术 1）梯度沉降分离法 2）等密度沉降分离法 3）流式细胞仪分离法 3 细胞破碎方法 1）超声波破碎法 2）反复冻溶法 3）化学裂解法 4）高速组织倒碎法 4 细胞器的分离 5 胞质体、核体和微细胞的制备 最常使用方法是： 物理法结合显微操作技术 化学法结合离心技术制备 1）胞质体 首先用细胞松弛素B处理细胞诱发其排核，然后震荡离心分离得到胞质体。 2）核体 在得到胞质体的同时，离心收集排除的有完整细胞核，带有少量细胞质并围有完整细胞膜的结构便是核体。 3）微细胞 首先用秋水仙素处理，染色体停滞在有丝分裂中期，体外培养过程中，在单个染色体或染色体周缘会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。 6 细胞器拆合重组举例 细胞器的移植主要是指叶绿体和线粒体的移植。 如卡尔森用白化型原生质体摄取正常的叶绿体，进而发育成正常的绿色植物；或有人用抗药型草履虫的线粒体植入敏感的草履虫细胞，使后者获得抗药性等。 二、 细胞融合(cell fusion) （一） 、细胞融合的概念 用人工方法把同种或不同种的两个或两个以上的细胞，通过介导物作用，融合成一个细胞的技术。亦称体细胞杂交（somatic hybridization） （二）、 细胞融合的意义（应用） 1 进行基因定位，绘制人类基因图 基因定位的方法 家系分析法 细胞融合法 基因剂量效应法 重组DNA法 分子杂交法 限制性片段长度多态性技术 脉冲电泳法（PEGE） 基因图：指将人类染色体上所有基因按其具体位置、次序和间隔距离详细地排列而成的图，又叫染色体连锁图 2 诱导PC染色体 3 体细胞杂种的致瘤性分析 4 遗传缺陷的基因互补 5 分化功能表达调控的研究 6 淋巴细胞杂交瘤技术与单克隆抗体 ☆　由单个杂交瘤细胞增殖产生的克隆细胞群分泌的高度纯一的抗体称为单克隆抗体 7 植物细胞的原生质体融合培育杂种植株 8 核质相互作用关系 9 基因治疗 10 疾病诊断 （三）、细胞融合的机理 膜融合是两个不同的膜相互接触和融合，导致两膜脂和膜蛋白的相互混合及两侧内含物的混合。细胞融合的基本步骤包括： 1 细胞密切靠近 2 细胞桥形成 3 细胞质渗透 4 细胞核融合 ★ 融合机制种种 1） “脂无序”模型 Lucy，1970-1975 2）Ca2+诱导的侧向“相分离”模型 Papahadjopoulos 1978 3）六角形HII构象与膜融合 Cullis and Hope1978 4）Ca2+诱导局部脱水与膜融合 Wilschut and Hoekstra 1984 5）渗透模型与膜融合 Lucy 1986 6）质子泵驱动膜融合 刘树森1986 膜融合过程大体概