真菌的实验诊断2008.08.26——胡主任.ppt

真菌感染的实验诊断 天津医科大学总医院 胡志东 E-mail huzhidong27@163.com 真菌感染的危险因素： 中心静脉插管 尿道插管 广谱抗生素 气管插管 腹部外科 肠胃外营养 营养不良 住院时间 诊断方法 影像学 组织病理学/细胞学 培养 血清学 分子生物学方法： Platelia Aspergillus ELISA Fungitell assay PCR（unavailable） 真菌病实验室诊断主要内容 准确、快速检出真菌病原体 真菌镜检 真菌培养 组织病理 生理生化 血清学方法 分子生物学 真菌感染的诊断 直接涂片 真菌培养 组织病理＋真菌培养是“金标准” 有意义的真菌培养标本 非经口痰标本 非插管尿标本 血液或其他无菌体液(胆汁、胸腹水、脑脊液） 直接镜检的浮载液和染色剂 KOH-10~20%-皮肤标本 Gram stain-真菌均为阳性 Calcofluor white-荧光染色 India-ink-墨汁染色 LPCB-乳酸酚棉蓝 Immunofluorescence-免疫荧光 直接镜检 对痰、窦道排泄物及气管冲洗液等标本直接镜检可以看到透明分支的菌丝、脓血或痰太粘稠用10％KOH处理后再进行镜检 如果曲霉菌寄生与空气相通的器官中，镜检甚至可以看到曲霉头菌丝有隔，呈二叉型，45℃ 分枝。 直接镜检——酵母细胞 隐球菌病—直接镜检（墨汁染色） 有意义的涂片结果 机体内部标本如血液、腹水、CSF、脓肿穿刺液等 新鲜尿液见到大量菌丝及孢子 口腔、阴道、支气管灌洗液见到酵母样菌应作培养确定 多细胞真菌形 态 真菌培养 真菌培养检查 目的—提高病原体检出的阳性率，确定致病菌的种类。 意义— —发现肯定的致病原如新生隐球菌时，诊断即可确立。 —分离出条件致病菌如白念珠菌或烟曲霉，应结合临床情况进行判断。 —无菌部位如血液或脑脊液中分离出条件致病菌常提示肯定的感染，但对来自于脓、痰或尿的标本则应谨慎解释结果。但任何一株培养物都不应轻易视为污染菌。 需结合直接镜检的结果，强调直接镜检与培养检查相结合的重要性。 强调临床医师与实验室检验人员之间的相互联系。 区分酵母样或霉样菌落 真菌体外药敏试验 真菌体外药敏试验 1 K-B 法 2 MIC 法 3 E-test 法 抗真菌药物体外敏感试验 液基稀释法 CLSI M27A2：致病性酵母菌 CLSI M38A：产孢丝状真菌 琼脂稀释法 纸片扩散法——CLSI M44-A E－test法 真菌特异性抗原的免疫学检测 1 (1-3)-?-D-葡聚糖 2 半乳甘露聚糖 3 甘露聚糖 4 D- 阿拉伯糖醇 5 烯醇化酶 6 新生隐球菌荚膜抗原 (1-3)-?-D-Glucan(葡聚糖) “G”试验 (1-3)-?-D-Glucan生物活性 (1-3)-?-D-Glucan作为真菌细胞壁成分之一，一旦进入机体后，将引起真菌病，严重时将会引起严重的深部真菌感染疾病，因此,深部真菌感染对患者的健康与生命构成严重威胁. 传统检测方法为真菌培养，一是周期长，二是阳性率特别低． 主要是抗生素类药物的滥用所引起． 真菌感染出现逐渐上升趋势． “G”试验缘何而来？ 比浊法反应机理 细菌内毒素 （1-3）?-D-Glucan LAL-RM(反应物) 因子C 活化因子C ? 因子B 活化因子B 活化因子G 因子G ?  凝固酶原 凝固酶 ? ? 凝固蛋白原 凝固蛋白（凝胶） 定量浊度仪 Turbidimetric technique GEL G 试验 1-3-β-D-Glucan 葡聚糖存在于念珠菌、曲霉等的细胞壁中，能特异性激活G因子，从而激活鲎试验，此过程称为G试验。 口咽部念珠菌病G试验结果阴性 隐球菌,毛霉菌感染G试验假阴性 (1→3)-β-D-葡聚糖检测 是酵母菌及丝状真菌细胞壁上的一种成分 内毒素检测方法 应用范围：曲霉菌、念珠菌、镰刀霉、毛孢子菌、酵母菌、足分支菌 隐球菌、毛霉菌除外 已在美国FDA以及一些欧洲国家得到批准 (1→3)-β-D-葡聚糖检测 美国主要针对念珠菌血症进行了研究 需要更多有关其它感染的研究信息（侵袭性曲霉菌病） 没有真菌感染的患者血液中也会出现β-D-葡聚糖： - 血液透析 - 使用血制品（白蛋白、丙球） - 使用含有葡聚糖的纱布 临床上阳性结果出现较晚 使用某种