人突触相关蛋白抗原表位分析_抗体制备和表达研究.pdfVIP

2004 ; 31 ( 12) 　　 　　 　　　生物化学与生物物理进展 　　 Prog. Biochem. Biophys. ·1119 · 人突触相关蛋白抗原表位分析 、 抗体制备及表达研究 杨向东 　王 　仁 　刘俊文 　屈顺林 　郭 　芳 　王 　蕾 　盛树力 (南华大学心血管病研究所 , 衡阳 421001) 摘要 　突触相关蛋白家族成员的功能与神经突触膜上的谷氨酸酯受体和钾离子通道的定位和功能有关 , 参与神 ( ) 经递质的释放 、神经的生长 、发育及修复. 为分析一个新的人突触相关蛋白基因 FRG4 的抗原表位和该蛋白 质在血管细胞的表达 , 从人胎肝文库 PCR 扩增获得 FRG4 基因全长 cDNA 序列. 通过生物信息学分析 , 预测 FRG4 编码氨基酸序列的二级结构 、抗原决定簇和功能结构域 ; 选取抗原 13 肽 PKLVKEEVFWRNY , 采用固相多肽合成 法合成了 FRG4 抗原多肽 , 免疫新西兰白兔获得兔抗人 FRG4 多抗 ; 免疫组化检测该蛋白质在人血管细胞中的表 达. 高效液相色谱检测显示制备的兔抗人 FRG4 多克隆抗体纯度达 8279 % , 抗体滴度为 11∶6 000 , 蛋白质印迹证 实该抗体具有较好的反应性和特异性 , 免疫组化证实 , 其主要在平滑肌细胞和内皮细胞的胞浆中表达. 结果表 明 , 成功制备了兔抗人 FRG4 抗体 , FRG4 蛋白主要在细胞胞浆中表达 , 与生物信息学分析结果一致. 关键词 　动脉粥样硬化 , 巨噬细胞 , 突触相关蛋白, 多肽合成 , 生物信息学 学科分类号 　R361 　　动脉粥样硬化 (atherosclerosis , As) 性心、脑 1 　材料和方法 血管疾病在老年人群中发病广 、危害重 , 目前对其 发病机制尚未完全阐明. 巨噬细胞在 As 的整个病 11 　主要试剂和细胞 变发生和发展过程中均能检测到 , 其功能意义不仅 细胞培养基 、胎牛血清 、完全弗氏佐剂及不完 ( ) 全弗氏佐剂购 自 GIBCO 公司 ; ABC 免疫组化试剂 是吞噬氧化修饰的低密度脂蛋白 oxLDL , 清除 毒性物质 , 形成泡沫细胞 , 同时还有许多其他重要 盒为武汉博士德公司产品; BCA 蛋白分析试剂盒和 功能 , 如与 As 斑块稳定性和机体的免疫功能密切 化学发光底物购 自 PIERCE 公司 , EL ISA 试剂盒购 相关. 从分子和基因水平研究巨噬细胞泡沫化机 自北京利科公司 ; 多肽合成所用氨基酸及其他相关 制 , 对于 As 发病机制和防治研究具有重要意义[ 1] . 试剂购 自ACT 公司. 新西兰 白兔由首都医科大学 我们应用抑制消减杂交 ( SSH) 筛选 oxLDL 致单核 北京宣武医院提供 , 人肝癌细胞株 Hep G 和人巨噬 2 细胞株 U937 细胞泡沫化过程中差异表达基因 , 获 细胞株 THP1 细胞购 自武汉大学典型培养物保藏中 得 20 多个差异表达的表达序列标签 ( EST) , 其中 心 , 人脐动脉平滑肌细胞和脐静脉内皮细胞由本室 两个片段经 GenBank 检索是新的 EST 序列 , 登录在